三尖杉內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其活性研究.pdf

1、內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指那些在其生活史中某一段時期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，包括營表生的腐生真菌和對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原真菌和菌根菌。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌具有抗真菌、抗腫瘤和抗氧化等作用，同時與植物有一定的共生進化關(guān)系。這些作用的存在與植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的新天然產(chǎn)物，甚至可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物有很大的相關(guān)性，因而對植物內(nèi)生真菌的研究可以尋找植物與內(nèi)生真

2、菌的協(xié)同進化關(guān)系，同時又是一個尋找天然產(chǎn)物的重要途徑。
　　 本課題以藥用植物三尖杉(Cephalotaxus fortunei)為研究材料，在內(nèi)生真菌的種類組成、內(nèi)生真菌活性菌株的篩選及內(nèi)生真菌菌株次生代謝產(chǎn)物探索等方面進行研究。取得如下結(jié)果：
　　 從浙江建德地區(qū)三尖杉樣品樹皮中共分離得到內(nèi)生真菌160株，經(jīng)過形態(tài)鑒定與分子鑒定，確定分屬于10個目、14個科、16個屬一共20個分類單元。根據(jù)形態(tài)鑒定的結(jié)果及對不產(chǎn)孢菌

3、株形態(tài)型的劃分結(jié)果，選取20個分類單元中的三尖杉內(nèi)生真菌的代表菌株，以稻瘟霉(Pyricularia oryzae P-2b)為篩選模型，初步篩選內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物活性，其中8株（40.0％）有抑制稻瘟霉活性。進一步體外抗真菌、抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，5株（25.0％）內(nèi)生真菌產(chǎn)物的抗白色念珠菌(Candida albicans)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、

4、薰煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)活性較好，4株（20.0％）內(nèi)生真菌產(chǎn)物的抗胃癌細胞（MKN45）、腸癌細胞（LOVO）、肝癌細胞（HepG2）、白血病細胞（HL-60）活性較好。其中，以菌株S361（Trichoderma atroviride）的抗真菌活性與S261（Penicillium sp.）的抗腫瘤活性最為顯著。
　　 選取菌株S361與菌株S261，分別大量發(fā)酵，對其發(fā)酵產(chǎn)物的萃取產(chǎn)物進行化

5、學(xué)分離。采用柱層析和制備薄層色譜等方法從S361發(fā)酵液的乙酸乙酯部位（AEF）中分離得到20個化合物，經(jīng)波譜學(xué)分析以及對照品比較的方法，鑒定了其中15個化合物，其中3個trichodermanin A, trichoderiols A and B為新化合物。從S261發(fā)酵液的乙酸乙酯部位（AEF）中分離得到11個化合物，經(jīng)波譜學(xué)分析以及對照品比較的方法，鑒定了其中5個，均為已知化合物。
　　 對3個新化合物分別進行了抗真菌以及抗

6、腫瘤活性檢測。發(fā)現(xiàn)trichodermanin A對于白色念珠菌(Candida albicans)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)有較好的抑制作用；trichoderiols A對于新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)有較好的抑制作用；trichoderiols B對于新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)

7、 有較好的抑制作用。3個化合的抗腫瘤活性一般，對胃癌細胞（MKN45）、腸癌細胞（LOVO）、肝癌細胞（HepG2）、白血病細胞（HL-60）均無明顯的抑制活性。
　　 通過以上研究，得到一些有意義的結(jié)果，主要包括：（1）從三尖杉中分離得到160株內(nèi)生真菌，對部分菌株進行了鑒定，并且篩選出了若干生物活性較好的菌株（S261，S361等），表明三尖杉內(nèi)生真菌物種多樣性豐富，是龐大的微生物資源庫；（2）菌株S361，S261的乙酸乙

8、酯部位生物活性較好，具有豐富的化學(xué)成分；（3）分離獲得2株生物活性較強、產(chǎn)量較高、相對穩(wěn)定的內(nèi)生真菌，通過柱層析對這2株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化，得到單體化合物31個，最終鑒定出20個化合物，均與三尖杉中已報道的主要成分不同；（4）trichodermanin A, trichoderiols A and B為新化合物，且有一定的活性，進一步表明內(nèi)生真菌是重要的新藥資源庫。
　　 綜上所述，本課題為開發(fā)應(yīng)用三尖杉內(nèi)生真菌及