亞油酸和聚蘋果酸雙接枝殼聚糖新型納米載體材料及共增強(qiáng)抗腫瘤藥物功效研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病,化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性差,毒副作用大,治療效果不理想。開發(fā)新型給藥系統(tǒng)(Drug DeliverySystem,DDS)提高現(xiàn)有抗腫瘤藥物療效,減少毒副作用,可降低新藥開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),藥物的安全性也更加可靠,已成為癌癥治療研究的熱點(diǎn)。納米給藥系統(tǒng)由于可緩、控釋藥物及靶向給藥而受到廣泛關(guān)注,納米給藥系統(tǒng)的載體材料必須具有良好的安全性才能進(jìn)一步用于臨床或生產(chǎn)上市。殼聚糖因良好的生物相容性和生物可降解性而

2、獲得廣泛應(yīng)用,是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的載體材料之一。本研究目的在于開發(fā)一種兩親性殼聚糖衍生物納米粒,并對(duì)其進(jìn)行PEG、葉酸(Folic acid,FA)和生物素(Biotin,BT)功能化修飾,使其成為一種安全、高效、可主動(dòng)靶向腫瘤組織的抗癌藥物給藥載體。
　　 以酰氯化反應(yīng)制備亞油酸(LA)和聚蘋果酸(PMLA)雙接枝殼聚糖(LMC),希夫堿反應(yīng)與EDC·HCl脫水縮合反應(yīng)制備功能化修飾的LMC衍生物:PEG修飾的LMC(PEG-L

3、MC)、葉酸修飾的PEG-LMC(FA-PEG-LMC)及生物素修飾的PEG-LMC(BT-PEG-LMC);LMC及其衍生物在水中自組裝形成納米粒;以紫杉醇(PTX)為難溶性抗腫瘤模型藥物研究LMC及其衍生物納米粒的理化性質(zhì)、載藥特點(diǎn)及體外釋藥規(guī)律;以H22荷瘤小鼠為模型,考察載PTXLMC及其衍生物納米粒的抑瘤率;以SMMC-7721為腫瘤細(xì)胞模型、HEK-293為正常細(xì)胞模型研究LMC及其衍生物納米粒的體外細(xì)胞攝取;以正常小鼠和H

4、22荷瘤小鼠為模型,研究LMC及其衍生物納米粒的體內(nèi)組織分布及靶向性。
　　 1LMC及其功能化修飾衍生物的制備與表征
　　 以D,L-天冬氨酸為起始單體,乳酸為引發(fā)劑,采用內(nèi)酯開環(huán)聚合法合成一種含乳酸末端的聚蘋果酸芐酯(PMLABz);以甲基磺酸為溶劑,酰氯法活化亞油酸和聚蘋果酸芐酯,使其與殼聚糖的羥基以酯鍵連接或與氨基以酰胺鍵連接,制備LMC。考察亞油酸和聚蘋果酸的投料比、投料順序、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)LMC接枝反應(yīng)

5、的影響,確定LMC的制備純化工藝:亞油酸與殼聚糖單元摩爾比為0.2～1.0,蘋果酸單體與殼聚糖單元摩爾比為1.0,室溫反應(yīng)6h,以甲基磺酸脫保護(hù)基,利用LMC的pH敏感性純化產(chǎn)物。
　　 DMSO-醋酸酐法制備mPEG醛,考察醋酸酐與mPEG的摩爾比、反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)mPEG醛活化率的影響,制得活化率80％以上的mPEG醛。mPEG醛與LMC在DMSO和pH8.0硼酸緩沖液混合溶劑中反應(yīng),硼氫化鈉還原,離心純化制得PEG-L

6、MC。
　　 經(jīng)EDC·HC1介導(dǎo)的縮合反應(yīng)將葉酸和生物素接枝至PEG-LMC上,制得FA-PEG-LMC和BT-PEG-LMC。確定其制備工藝:以EDC·HC1、NHS、DMAP催化反應(yīng),透析法純化產(chǎn)物。
　　 采用FTIR、1HNMR、X射線衍射、DSC和元素分析表征了LMC及其衍生物的結(jié)構(gòu)。元素分析結(jié)果表明亞油酸的取代度(DS)介于36.1～60.5之間,PMLA的DS介于0.7～1.1之間,PEG、FA和BT的D

7、S分別為12.4,6.0和6.1。
　　 2LMC及其衍生物納米粒的制備、表征及載藥、釋藥特性
　　 以PTX為模型藥物,研究LMC及功能化修飾的LMC衍生物自組裝納米粒作為難溶性抗癌藥物載體的特點(diǎn)。超聲法制各LMC及其衍生物自組裝納米粒;透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)考察納米粒的形態(tài),動(dòng)態(tài)激光光散射法(DLLS)測(cè)定納米粒的粒徑與Zeta電勢(shì),穩(wěn)態(tài)熒光探針法測(cè)定納米粒的臨界聚集濃度(CAC);制備載

8、PTXLMC及其衍生物納米粒,考察親疏水組分比例與PEG、FA和BT修飾對(duì)包封率、載藥量和體外釋放行為的影響。
　　 LMC及其衍生物納米粒在水中的平均粒徑為190～350nm,生理?xiàng)l件下Zeta電勢(shì)為-2～20mV。LMC的粒徑隨LA取代度的增加而減小,隨PMLA鏈長(zhǎng)的增加而增大,且堿性條件下的粒徑大于酸性條件。LMC納米粒的Zeta電勢(shì)受介質(zhì)pH值影響,pH＜6.0時(shí)帶正電,6.0＜pH＜7.0時(shí)電荷接近0,pH＞7.0時(shí)帶

9、負(fù)電。PEG修飾增大LMC納米粒的粒徑,且可屏蔽納米粒表面電荷,使其Zeta電勢(shì)絕對(duì)值降低。FA和BT修飾對(duì)PEG-LMC的粒徑和Zeta電勢(shì)無明顯影響。LMC的CAC隨LA取代度的增加而減小,PEG、FA和BT修飾不明顯改變CAC。LMC及其衍生物納米粒對(duì)PTX的包封率均超過70％,最高可達(dá)90％;載藥量隨LA取代度的增加而增加,最高可達(dá)9.9％,PEG修飾使載藥量略有降低。載PTXLMC納米粒4h的累積釋放率約為50～60％,8h的

10、累積釋放率約為70～80％,可持續(xù)釋放藥物達(dá)24h。LA取代度較大、PMLA鏈較長(zhǎng)的LMC納米粒釋藥速度較慢,PEG修飾可增強(qiáng)LMC納米粒的緩釋能力。
　　 3載紫杉醇納米粒的抗腫瘤作用、體內(nèi)外靶向性及安全性
　　 考察載PTXLMC及其衍生物納米粒對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤效果,結(jié)果抑瘤率強(qiáng)弱順序?yàn)?FA-PEG-LMC＞BT-PEG-LMC＞PEG-LMC＞LMC＞PTX溶液,其中FA-PEG-LMC與BT-PEG-LM

11、C的抑瘤率分別為82.5％和80.6％,可有效抑制H22腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 細(xì)胞攝取試驗(yàn)考察LMC及其衍生物納米粒的體外腫瘤細(xì)胞靶向性。制備羅丹明B標(biāo)記的LMC納米粒(RB-LMCNP)、PEG-LMC納米粒(RB-PEG-LMCNP)、葉酸修飾的LMC納米粒(RB-FA-LMCNP)、葉酸修飾的PEG-LMC納米粒(RB-FA-PEG-LMCNP)、生物素修飾的LMC納米粒(RB-BT-LMCNP)和生物素修飾的PEG-LMC

12、納米粒(RB-BT-PEG-LMCNP),考察其在SMMC-7721細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞中的攝取。結(jié)果表明SMMC-7721腫瘤細(xì)胞對(duì)LMC及其衍生物納米粒的攝取能力強(qiáng)于HEK-293正常細(xì)胞;納米粒濃度低于1000μg·mL-1時(shí),SMMC-7721細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取量隨納米粒濃度的增加而增加;納米粒濃度低于500μg·mL-1時(shí),HEK-293細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取量隨納米粒濃度的增加而增加;4h內(nèi),SMMC-7721和HEK-29

13、3細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取量隨共培育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。FA和BT修飾的LMC納米粒在SMMC-7721細(xì)胞中的攝取量顯著高于LMC納米粒(FA-LMC和BT-LMC的攝取量分別為L(zhǎng)MC的3～5倍和2～3倍),在HEK-293正常細(xì)胞中的攝取量顯著低于SMMC-7721腫瘤細(xì)胞,表明FA和BT修飾的LMC納米?？蛇x擇性地主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞。PEG修飾對(duì)LMC納米粒的攝取無明顯影響,但同時(shí)修飾配體和PEG的FA-PEG-LMC和BT-PEG-LMC

14、的細(xì)胞攝取量低于FA-LMC和BT-LMC。游離葉酸及生物素可抑制相應(yīng)FA和BT修飾的納米粒的攝取,對(duì)FA-PEG-LMC和BT-PEG-LMC納米粒的抑制率高于FA-LMC和BT-LMC,表明FA-LMC和BT-LMC對(duì)細(xì)胞表面葉酸和生物素受體親和力更強(qiáng)。
　　 以正常小鼠和荷H22腫瘤小鼠為模型,考察載PTX的LMC納米粒、PEG-LMC納米粒、FA-PEG-LMC納米粒與BT-PEG-LMC納米粒的體內(nèi)組織分布和腫瘤靶向性

15、。HPLC測(cè)定體內(nèi)藥物濃度,方法專屬性、精密度、回收率均較好。PEG-LMC組血液中藥物濃度時(shí)間曲線下面積(AUC)為L(zhǎng)MC組的3.05倍,肝中AUC為L(zhǎng)MC組的61％,脾中AUC與LMC組相近,表明PEG修飾可顯著延長(zhǎng)納米粒在血液中的循環(huán)時(shí)間,減少肝巨噬細(xì)胞的吞噬,但無法避免脾巨噬細(xì)胞的吞噬;LMC、PEG-LMC、FA-PEG-LMC與BT-PEG-LMC納米粒均具有一定的腫瘤靶向性,腫瘤相對(duì)攝取率(Re)分別為1.36、2.51、