新疾病——外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫病原菌分子生物學(xué)鑒定及發(fā)病機(jī)制初步探索.pdf

1、引言：外傷后細(xì)菌性致死性肉芽腫(Fatalbacteriagranulomaaftertrauma，F(xiàn)BGT)是由高天文教授發(fā)現(xiàn)并命名的一種新疾病，該病在面部外傷愈合后發(fā)生，預(yù)后極差，患者死亡時(shí)均有腦部受累癥狀。以往國內(nèi)多位專家曾先后診治過近20例，進(jìn)行了認(rèn)真的普通細(xì)菌分離、厭氧菌分離、真菌培養(yǎng)等研究，均未獲陽性結(jié)果；曾診為“結(jié)節(jié)病、真菌感染”，給予糖皮質(zhì)激素、抗生素、抗結(jié)核、抗真菌等治療，效果不佳，患者全部在發(fā)病后的1到4年內(nèi)死亡。在

2、總結(jié)、分析前人分離、培養(yǎng)該病病原失敗的基礎(chǔ)上，采取嚴(yán)格厭氧、運(yùn)送培養(yǎng)基及增菌肉湯等改進(jìn)措施后，本課題組其他成員終于成功地從4例FBGT患者的皮損組織中分離培養(yǎng)出病原菌，初步研究表明該菌為革蘭陽性桿菌，但具體種屬不明。由于病原菌種屬、患者的致死機(jī)理等不明，盡管采取各種積極的治療措施，除我們所救治的6例患者中有1例獲救外，至今尚無救治成功的病例。FBGT的發(fā)病機(jī)制、致死機(jī)理的闡明已成為救治患者的關(guān)鍵。 目的： 1.分別采取P

3、CR擴(kuò)增FBGT患者皮損分離病原菌16SrRNA、測序結(jié)果BLAST比對(duì)及患者分離菌與P.acnes標(biāo)準(zhǔn)株DNA雜交方法明確病原菌的種屬；采用細(xì)菌16SrRNAPCR的方法，檢測2例行尸檢患者(病例2和3)的病變腦組織是否存在細(xì)菌，闡明患者死亡原因，測序結(jié)果與皮損分離菌序列比對(duì)，明確腦內(nèi)細(xì)菌是否與各自患者皮損分離菌為同一細(xì)菌，進(jìn)一步證實(shí)從患者皮損分離的細(xì)菌就是FBGT的病原菌。 2.通過PCR擴(kuò)增病例2的IFN-γ相關(guān)分子(IA

4、M，包括IFN-γR1、R2、STAT1、IL-12β、IL-12Rβ1、β2和STAT4)的所有外顯子，測序結(jié)果與多個(gè)數(shù)據(jù)庫的野生型序列比較，尋找可能引起相應(yīng)的IAM分子功能缺陷的多態(tài)性位點(diǎn)，初步明確FBGT的發(fā)病機(jī)制。 方法： 1.FBGT患者皮損分離病原菌分子生物學(xué)鑒定及死亡原因分析 1)4例FBGT患者皮損分離病原菌16SrRNA鑒定 (1)提取皮損分離菌的基因組DNA； (2)利用細(xì)菌通

5、用引物擴(kuò)增皮損分離菌的16SrRNA； (3)測序結(jié)果通過BLAST與已知細(xì)菌的16SrRNA序列進(jìn)行同源 性比對(duì)，明確FBGT患者皮損分離菌的具體種屬。 2)皮損分離病原菌與P.acnes標(biāo)準(zhǔn)株DNA雜交 (1)DNA結(jié)合：采用共價(jià)法結(jié)合DNA到微孔板法進(jìn)行DNA-DNA雜交，每個(gè)樣品4個(gè)平行重復(fù)； (2)標(biāo)記DNA：photo-activatablebiotin(PAB)標(biāo)記探針DNA；

6、 (3)雜交 (4)測定雜交率：50℃雜交12小時(shí)，分別用2×SSC-0.1％Tween2050℃和室溫洗3次(15分鐘)，堿性磷酸酶法FLUOstarOPTIMA(BMD)測定雜交率(360nm激發(fā)和460nm輻射)。 3)2例死亡患者病變腦組織細(xì)菌16SrRNA檢測、死亡原因分析(1)提取2例行尸檢患者(病例2和3)的病變腦組織基因組DNA； (2)病變腦組織細(xì)菌16SrRNAPCR檢測，明確患者死亡原因；

7、 (3)測序結(jié)果分別進(jìn)行BLAST比對(duì)，初步明確病變腦組織內(nèi)細(xì)菌的種屬，并與各自患者皮損分離菌的16SrRNA序列進(jìn)行比較，明確病變腦組織內(nèi)的細(xì)菌與皮損分離菌是否為同一細(xì)菌，進(jìn)一步證實(shí)皮損分離菌就是FBGT的病原菌。 2.IAM基因外顯子擴(kuò)增、功能缺陷多態(tài)性位點(diǎn)確定在本課題第一部分已明確P.acnes就是FBGT的致病菌的基礎(chǔ)上，通過綜合分析FBGT患者的表型，結(jié)合P.acnes毒力低，為胞內(nèi)寄生菌等特點(diǎn)，充分借鑒他人研

8、究成果，提出了IAM基因多態(tài)性是FBGT發(fā)病的重要機(jī)制的假說。進(jìn)行了以下工作： 1)設(shè)計(jì)IAM相關(guān)分子基因所有外顯子(包含5'和3端的片區(qū))的引物，并對(duì)引物進(jìn)行BLAST比對(duì)，確保特異擴(kuò)增； 2)PCR擴(kuò)增，直接測序，測序結(jié)果與多個(gè)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(http：//egp.gs.washington.edu/、Genecard等)的野生型序列比較，找出多態(tài)性位點(diǎn)； 3)針對(duì)此多態(tài)性位點(diǎn)重新設(shè)計(jì)引物，無關(guān)正常對(duì)照(1

9、0人)的相應(yīng)外顯子PCR擴(kuò)增，直接測序，證實(shí)正常人不存在此多態(tài)性位點(diǎn)； 4)通過PCR—單酶切分析進(jìn)一步證實(shí)病例2的多態(tài)性位點(diǎn)，并明確等位基因型； 5)綜合分析所發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)(三維構(gòu)像等)、表達(dá)和功能可能的影響，進(jìn)而確認(rèn)能引起相應(yīng)分子功能缺陷的多態(tài)性位點(diǎn)，初步明確FBGT的發(fā)病機(jī)制。 結(jié)果： 1.FBGT患者皮損分離病原菌16SrRNA鑒定、病變腦組織細(xì)菌16SrRNA檢測和死亡原因分析

10、 1)4例FBGT患者皮損分離病原菌16SrRNA基因序列經(jīng)BLAST比對(duì)后與已知P.acnes(AB097215.1GI：26006299)的同源性達(dá)99％，皮損分離病原菌為P.acnes; 2)2例尸檢患者病變腦組織內(nèi)均可檢測到細(xì)菌16SrRNA片段，患者死于細(xì)菌引起的腦感染；PCR測序結(jié)果與相應(yīng)患者皮損分離菌的16SrRNA序列完全一致，腦內(nèi)細(xì)菌與皮損分離菌為同一細(xì)菌。 2.IAM基因外顯子擴(kuò)增、功能缺陷多

11、態(tài)性位點(diǎn)確定 1)通過PCR測序與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)IAM重要成員-IL-12Rβ1基因第五外顯子存在一個(gè)錯(cuò)義突變(271G→A)，可引起所編碼氨基酸的改變(91T→A)，未發(fā)現(xiàn)其他IAM分子基因外顯子存在無義或錯(cuò)義突變； 2)檢索多個(gè)多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(http：//egp.gs.washington.edu/、Genecard等)，未發(fā)現(xiàn)與IL-12Rβ1基因第五外顯子錯(cuò)義突變(271G→A)一致的多態(tài)性位點(diǎn)； 3)

12、10名正常對(duì)照IL-12Rβ1基因第五外顯子在相應(yīng)多態(tài)性位點(diǎn)均為野生型(271G/G)； 4)PCR-NaeI單酶切分析進(jìn)一步證實(shí)病例2的IL-12Rβ1基因第五外顯子突變?yōu)闉榧兒闲湾e(cuò)義突變(271A/A)： 5)IL-12Rβ1的錯(cuò)義突變(271G→A)位于配體識(shí)別的關(guān)鍵區(qū)域，該突變可引起所編碼氨基酸的理化性質(zhì)改變(疏/親水性)，進(jìn)而引起IL-12Rβ1三維構(gòu)像改變，綜合分析證實(shí)此錯(cuò)義突變(271G→A)可引起IL-1

13、2Rβ1與配體結(jié)合能力下降，導(dǎo)致IL-12Rβ1功能缺陷。 結(jié)論： 1.本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)方法明確了P.acnes為新疾病FBGT的病原，患者的死亡原因?yàn)镻.acnes所致的腦感染。 2.依據(jù)FBGT的臨床特點(diǎn)，通過廣泛查閱相關(guān)文獻(xiàn)，提出IAM基因多態(tài)性引起相應(yīng)分子功能的缺陷是FBGT發(fā)病機(jī)制的假說；以此為基礎(chǔ)，檢測了病例2的IAM基因的所有外顯子，發(fā)現(xiàn)IAM的重要成員-IL-12Rβ1第5