臨床分離的紅色毛癬菌肉芽腫株生物學性狀及毒力的初步研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分：紅色毛癬菌肉芽腫株和淺表感染株的生物學性狀和基因型的比較研究
　　目的：研究紅色毛癬菌肉芽腫株和淺表感染臨床株生物學性狀和基因型。
　　方法：收集南京總醫(yī)院皮膚科門診2013年4月-2015年5月就診的3例紅色毛癬菌肉芽腫患者和2015年4月就診的11例淺表感染患者的臨床分離菌株。紅色毛癬菌標準株ATCCMYA4438和須癬毛癬菌CMCC(F)T5a。
　　(1)將

2、臨床分離菌株進行純化，傳代，然后接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置于27℃培養(yǎng)箱下，培養(yǎng)10天。觀察菌落外觀、質地及背面顏色。采用傳統(tǒng)形態(tài)學方法和分子生物學對分離菌株進行鑒定。
　　(2)將全部分離株接種馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，28℃孵育7d挑取紅色毛癬菌菌落置入研磨器中，加入生理鹽水，研磨后制成均勻菌懸液，用血細胞計數(shù)板調整孢子濃度為1×107CFU/mL。
　　(3)將肉芽腫株和標準株菌ATCCMYA4438懸液以移液槍

3、取10μL菌懸液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板中，每株接種18個，分別置于25℃、27℃、35℃、37℃、39℃、41℃各3個。淺表感染分離株菌懸液30株以移液槍取10μL菌懸液接種于PDA平板中，每株接種6個，分別置于27℃、37℃下各3個。逐日觀察比較菌落形態(tài)大小變化，觀察3周，拍照并測量記錄下14天和21天時菌落最外直徑。實驗重復操作3次，取平均值。
　　(4)按照美國國家臨床和實驗室標準的M38-A2方案采用微量液體稀釋

4、法在體外進行藥敏試驗。在含抗真菌藥物的96孔板的1-11列孔加入2倍終濃度的菌懸液，27℃溫箱孵育，7天后觀察結果。4種抗真菌藥物為伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑。檢測分離株最低抑菌濃度(MIC)，以ATCCMYA4438為質控株。實驗重復操作至少3次，取平均值。
　　(5)用Bi-opsin真菌基因組DNA提取試劑盒按照說明提取菌株DNA，對菌株TRS-1(NTS區(qū)內串聯(lián)重復亞單位1)、TRS-2區(qū)(NTS區(qū)內串聯(lián)重復亞單

5、位2)進行PCR擴增鑒定菌株基因型。PCR反應產物的檢測:用1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠程序系統(tǒng)中觀察結果，并采集保存圖像，剩余肉芽腫株PCR產物送Invitrogen貿易有限公司測序，測序結果與genebank基因序列比對分析。
　　(6)采用SPSS20軟件，運用隨機區(qū)組設計資料的方差分析和配對樣本t檢驗分本析對菌落直徑數(shù)值進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:(1)菌株鑒定結果3株肉芽腫患者臨床分離株經傳統(tǒng)培養(yǎng)及分子生物學鑒

6、定為紅色毛癬菌。11株淺表感染患者臨床分離株經傳統(tǒng)培養(yǎng)均鑒定為紅色毛癬菌。
　　(2)紅色毛癬菌溫度試驗結果經過隨機區(qū)組設計資料的方差分析，紅色毛癬菌肉芽腫株3株和標準株ATCC4438菌株和溫度都有差異(P＜0.05、P＜0.05)。14天、21天標準株ATCC4438在25℃、27℃培養(yǎng)條件下菌落直徑大于其在35℃、37℃培養(yǎng)條件下的菌落直徑，三株肉芽腫菌株在35℃、37℃、27℃三個溫度條件下菌落直徑均無差異(P＞0.05)

7、，39℃、41℃下肉芽腫株不生長。11株淺部感染分離株在27℃培養(yǎng)條件下菌落直徑均大于其在37℃培養(yǎng)條件下的菌落直徑(P＜0.05)。
　　(3)體外藥物敏感試驗結果肉芽腫株和淺部感染株對伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑的MIC值均在正常范圍內，無耐藥株出現(xiàn)。
　　(4)基因型分析結果TRS-1區(qū)根據條帶不同分為4型，NJT001、淺2、淺4、淺7、淺10為type1型;NJT002、ATCC4438、淺3、淺5、淺6、

8、淺9、淺11為type2型;淺1為type3型;NJT003、淺8為type4型。TRS-2區(qū)根據條帶不同可分為2型，肉芽腫株和標準株均在500bp處形成條帶，僅有淺5在400bp左右條帶。NJT001TRS-1區(qū)序列長441bp，與GenBank中紅色毛癬菌(AF222889)有1個堿基差異;TRS-2區(qū)序列長508bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有3個堿基差異。NJT002 TRS-1區(qū)序列長

9、605bp，與GenBank中紅色毛癬菌(AF222887)有16個堿基差異，TRS-2區(qū)序列長509bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有3個堿基差異。NJT003 TRS-1區(qū)序列長898bp，與GenBank中紅色毛癬菌(JX431933)有19個堿基差異，TRS-2區(qū)序列長508bp與GenBank中紅色毛癬菌(AF222890、AF222887)均有2個堿基差異。
　　結論:紅色毛癬菌

10、肉芽腫株的鑒定需要病理學和分子生物學等才能明確鑒定。本文中紅色毛癬菌肉芽腫株較淺表感染分離株更耐熱，肉芽腫株和淺表分離株對伏立康唑、伊曲康唑、特比萘芬和酮康唑的敏感性無差異，均未發(fā)生耐藥。肉芽腫株和淺表分離株基因分型無差異。3株肉芽腫菌株TRS-1區(qū)序列與GenBank中的紅色毛癬菌分別有1、3和19個堿基差異，TRS-2區(qū)序列與GenBank中的紅色毛癬菌分別有2-3個堿基差異，從而推測三例肉芽腫菌株可能是紅色毛癬菌的一個變種。

11、>　　第二部分：紅色毛癬菌感染BalB/C鼠肉芽腫模型的構建
　　目的：紅色毛癬菌不僅引起皮膚淺部感染還可引起深部感染，但相關動物模型未見研究報道。本部分擬構建紅色毛癬菌感染的癬菌性肉芽腫模型。
　　方法：紅色毛癬菌肉芽腫分離株3株，來自2013年4月到2015年5月南京總醫(yī)院皮膚科門診的3位紅色毛癬菌肉芽腫患者組織，分離自體癬患者的體癬株2株，菌株均經傳統(tǒng)方法的分離培養(yǎng)并經分子生物學鑒定，依次命名為NJT001-NJT00

12、3、淺1和淺2。紅色毛癬菌標準菌株ATCCMYA4438。
　　(1)普通級健康BalB/C小鼠52只，隨機分為13籠，4只小鼠置于1籠，編號為1-13。將13籠小鼠分為3組，第1組為空白對照組（為第1籠，不接種紅色毛癬菌）;第2組為PBS菌懸液組，第2-7籠，依次接種NJT001、NJT002、NJT003、淺1、淺2和ATCCMYA4438紅色毛癬菌PBS菌懸液。第3組為實驗組，第8-13籠，依次接種NJT001、NJT002

13、、NJT003、淺1、淺2和ATCCMYA4438紅色毛癬菌黏液素菌懸液。
　　(2)除空白對照組外，接種前7d開始，每日1次給予地塞米松磷酸鈉注射液25mg.kg-1·d-1腹腔注射BalB/C鼠。將實驗菌株制成無菌的PBS和無菌的黏液素溶液(5g/100ml)菌絲段（含分生孢子）懸液，在細胞計數(shù)板下調整菌絲段/孢子濃度為1×108/ml待用。
　　(3)接種時對小鼠足墊進行常規(guī)消毒，用1ml注射器吸取上述菌懸液，向小鼠一

14、只足墊中注射0.2ml菌懸液，另一只作為陰性對照?？瞻讓φ战M注射0.2ml生理鹽水。
　　(4)各組動物給予地塞米松磷酸鈉注射液25 mg.kg-1·d-1腹腔注射，每天注射1次，共21次。每天觀察實驗動物接種處皮膚腫脹破潰變化。接種后第21天處死動物，取接種處皮膚膿液涂片進行直接鏡檢，同時將病變組織接種于含氯霉素和放線菌酮的PDA培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱27℃下培養(yǎng)。動物處死后，剪取接種處全層皮膚組織，中性甲醛固定，石蠟包埋切片，分別

15、行HE染色和PAS染色。
　　結果：(1)大體變化空白組、PBS菌懸液組和實驗組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后足墊注射菌懸液后出現(xiàn)腫脹，一周后腫脹逐漸消退，兩周后腫脹完全消退，與陰性對照無異。實驗組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠足墊注射菌懸液后出現(xiàn)腫脹，腫脹持續(xù)不消退，接種后第15天開始，小鼠足墊出現(xiàn)破潰和膿腫。直至動物處死，膿腫和破潰持續(xù)存在，無愈合傾向。
　　(2)直接鏡檢結果直接鏡檢可見實

16、驗組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠足墊膿液中存在細長菌絲，而空白組、PBS菌懸液組和實驗組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠足墊接種處均沒有膿液，故取組織加等滲鹽水研磨后進行直接鏡檢，均未見菌絲和孢子。
　　(3)組織培養(yǎng)結果實驗組NJT001、NJT002、NJT003處理后小鼠組織接種平板培養(yǎng)7天后，可見菌落生長，且與接種前菌落形態(tài)基本相同。小培養(yǎng)及分子生物學鑒定證實與接種菌株相同。而空白組、PB

17、S菌懸液組和實驗組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠組織培養(yǎng)21d后均未見真菌生長。
　　(4)組織病理結果HE染色下空白組、PBS菌懸液組、實驗組淺1、淺2和ATCCMYA4438處理后小鼠足部組織未見肉芽腫組織形成，實驗組NJT001、NJT002和NJT003處理后小鼠足部組織可見表皮角化過度，真皮內肉芽腫形成，內含中性粒細胞、淋巴細胞等大量炎細胞浸潤，同時還可見大片壞死區(qū)域。PAS染色下空白組、PBS菌懸液組和實