乙型腦炎病毒復(fù)制與細(xì)胞自噬的相互作用.pdf

1、細(xì)胞自噬(Autophagy)是真核細(xì)胞通過溶酶體途徑降解胞內(nèi)自身成份的過程，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用，同時也是天然免疫的組成部分，在細(xì)胞應(yīng)激包括抗病原體感染等過程中扮演重要角色。然而病原體在長期進(jìn)化過程中，獲得了逃避自噬抗感染作用的能力。有研究表明，某些種類的病毒通過其編碼的蛋白抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生，從而逃避自噬的清除作用；而一些正鏈RNA病毒包括黃病毒屬的登革病毒，可利用自噬泡作為復(fù)制位點，并通過誘導(dǎo)自噬的發(fā)生促進(jìn)自身增殖。乙

2、型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)作為嗜神經(jīng)性的黃病毒屬成員，其在感染細(xì)胞時能否誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，細(xì)胞自噬在乙型腦炎病毒感染過程中又扮演何種角色均不清楚。因此，揭示乙型腦炎病毒與宿主自噬現(xiàn)象的相互關(guān)系可為進(jìn)一步闡明該病毒的致病機(jī)制提供理論依據(jù)，并有助于制定乙型腦炎新型的防治策略。
　　 本研究采用自噬活動活躍的肝細(xì)胞系，通過免疫印跡和電鏡等手段檢測乙型腦炎病毒感染前后細(xì)胞發(fā)生自噬的水平

3、，進(jìn)一步采用藥物處理和基因沉默的方法改變細(xì)胞自噬狀態(tài)，比較不同自噬狀態(tài)下乙型腦炎病毒復(fù)制水平的差異，從而探討乙型腦炎病毒感染與細(xì)胞自噬的相互作用關(guān)系。
　　 1.乙型腦炎病毒感染對宿主細(xì)胞自噬的影響
　　 為了探討乙型腦炎病毒感染對細(xì)胞自噬現(xiàn)象的影響，我們首先利用透射電子顯微鏡對病毒感染的肝細(xì)胞系HepG2中自噬泡的形成情況進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，經(jīng)病毒感染以及用自噬誘導(dǎo)劑處理的HepG2細(xì)胞中均可觀察到典型的0.5-1μm

4、雙層膜的自噬泡結(jié)構(gòu)。然后我們通過免疫印跡的方法檢測乙型腦炎病毒感染HepG2細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的變化，發(fā)現(xiàn)病毒感染12h-36h后的細(xì)胞內(nèi)這兩種蛋白的比值增加，表明乙型腦炎病毒感染HepG2細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。為了進(jìn)一步驗證該結(jié)論，我們用表達(dá)GFP-LC3融合蛋白的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞及BHK-21細(xì)胞，然后再感染乙型腦炎病毒，利用熒光顯微鏡觀察GFP-LC3在細(xì)胞內(nèi)的聚點(puncta)情況。結(jié)果

5、顯示，病毒感染組發(fā)生聚點的細(xì)胞比率高于對照組。上述結(jié)果表明，乙型腦炎病毒感染不同細(xì)胞系包括HepG2細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞均可有效誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。
　　 2.細(xì)胞自噬對乙型腦炎病毒復(fù)制的影響
　　 為了探討宿主細(xì)胞自噬對乙型腦炎病毒復(fù)制的影響，我們通過人為藥物誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞的自噬，然后感染病毒，利用蝕斑試驗測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的子代病毒滴度，分析病毒復(fù)制水平的變化。我們首先對藥物誘導(dǎo)和抑制HepG2細(xì)胞自噬的條件進(jìn)行了

6、優(yōu)化，最終選用0.1μM雷帕霉素處理細(xì)胞6h作為誘導(dǎo)自噬的條件；0.5μM渥曼青霉素處理細(xì)胞1h作為抑制自噬的條件。我們觀察比較了不同自噬條件下乙型腦炎病毒感染后36h(病毒增殖的對數(shù)期)的復(fù)制水平，發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，自噬抑制條件下乙型腦炎病毒復(fù)制水平升高，且復(fù)制水平在一定范圍內(nèi)與自噬抑制劑的劑量呈正相關(guān)，表明細(xì)胞自噬對乙型腦炎病毒復(fù)制具有抑制作用。這種抑制作用存在一定的毒株特異性，對疫苗株復(fù)制的抑制作用較野生型毒株更為明顯。在自噬誘

7、導(dǎo)的條件下，野毒株復(fù)制水平無顯著變化，而疫苗株復(fù)制水平略有增加。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對疫苗株感染產(chǎn)生的復(fù)制增強(qiáng)作用可能與其參與免疫抑制效應(yīng)有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步分析。
　　 3.影響乙型腦炎病毒復(fù)制的自噬相關(guān)基因
　　 為了進(jìn)一步探討細(xì)胞自噬抑制乙型腦炎病毒復(fù)制的機(jī)制，我們對自噬相關(guān)蛋白對乙型腦炎病毒復(fù)制的影響進(jìn)行了分析。利用RNA干擾技術(shù)對涉及自噬泡形成的關(guān)鍵蛋白LC3及自噬誘導(dǎo)啟動蛋白Beclinl的基因進(jìn)行沉默，

8、感染病毒后通過蝕斑試驗測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的子代病毒量。結(jié)果顯示，沉默LC3基因使兩株病毒在相應(yīng)細(xì)胞中的復(fù)制水平均顯著提高，而沉默Beclinl基因后復(fù)制水平則無顯著差異。這表明LC3的正常表達(dá)對于細(xì)胞自噬發(fā)揮對乙型腦炎病毒的抑制作用具有重要意義；而Beclinl則可能不參與自噬對病毒復(fù)制的抑制作用。沉默LC3及Beclinl基因?qū)σ倚湍X炎病毒復(fù)制的影響不同提示我們并非所有的自噬相關(guān)因子都參與抗乙型腦炎病毒感染，而不同的自噬相關(guān)蛋白可能通