乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細胞的機制研究.pdf

1、目的:
　　流行性乙型腦炎又稱日本腦炎(Japanese encephalitis)，是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染所引發(fā)的人畜共患的自然疫源性疾病。乙腦在世界范圍內(nèi)傳播，尤其是東亞、東南亞、大洋洲北部地區(qū)為乙腦流行的主要地區(qū)，這些地區(qū)覆蓋了全球超過30億的人口。世界衛(wèi)生組織每年報告的乙型腦炎患者約有35，000-50，000人，死亡人數(shù)高達15，000人，存活患者中約有30

2、％-50％會留下麻痹癥、智力障礙等永久性神經(jīng)損傷后遺癥。近年來隨著全球化進程的加速、疫區(qū)旅游人數(shù)的增加以及病毒自身變異的影響，乙腦的發(fā)病率有逐步上升的趨勢，在局部地區(qū)存在乙腦疫情的暴發(fā)與流行。由此可見，乙型腦炎仍然是對世界公共衛(wèi)生安全的嚴重威脅，急需深入研究JEV致病機理，提供更加有效的預防手段并尋找新的抗病毒策略。
　　病毒感染宿主細胞是一個復雜的過程，為形成對靶細胞有效的感染，病毒必須先侵入至細胞內(nèi)。病毒顆粒需要跨過細胞膜屏障

3、并穿過擁擠的細胞質(zhì)到達細胞核周特定的區(qū)域釋放基因組，才能啟動復制過程并依次完成后續(xù)的蛋白合成、組裝與釋放。病毒入侵過程也是病毒自身與宿主細胞相互作用的過程，研究表明JEV入侵靶細胞可分為三個步驟:首先JEV通過包膜蛋白E結(jié)合至靶細胞表面受體并與之相互作用形成病毒-受體復合物，然后病毒通過受體介導的內(nèi)吞作用以內(nèi)吞小體的形式跨過細胞膜進入細胞內(nèi)并運輸至特定的位置，最后病毒通過膜融合作用完成病毒膜與內(nèi)體膜融合從而釋放病毒核酸。目前，對黃病毒科

4、病毒的入侵機制研究主要集中在西尼羅病毒(WNV)以及登革病毒（DENV）上，而對JEV的研究相對較少。對JEV入侵的深入研究，不僅可以解析病毒的感染機制，也可為黃病毒科病毒入侵機制的研究提供借鑒，更可探尋到新的有效的抗病毒靶點，從而在起始階段來阻斷病毒感染。
　　JEV感染具有嗜神經(jīng)性，易造成嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病及其并發(fā)癥，這也是導致乙型腦炎患者發(fā)展為重癥甚至死亡的主要原因。JEV在體內(nèi)擴增后，經(jīng)血液循環(huán)，能夠突破血腦

5、屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而致病。然而，目前針對JEV感染神經(jīng)系統(tǒng)的分子機制尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)JEV入侵神經(jīng)細胞在內(nèi)吞途徑上不同于JEV入侵其它非神經(jīng)類宿主細胞，可能與JEV的嗜神經(jīng)性和致病性高度相關(guān)。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，利用干擾RNA文庫對140個宿主細胞跨膜運輸相關(guān)分子在JEV入侵人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞過程中的具體功能進行研究，并篩選出能夠抑制JEV入侵神經(jīng)細胞的宿主分子。在此基礎(chǔ)上應用針對不同宿主分子和信號通路

6、的化學抑制劑以及顯性抑制突變體系統(tǒng)分析JEV感染SK-N-SH細胞所依賴的途徑及關(guān)鍵分子。旨在探尋參與JEV入侵神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵宿主分子，闡明JEV入侵神經(jīng)細胞的路徑及調(diào)節(jié)機制。
　　一、乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細胞的關(guān)鍵宿主分子篩選以及內(nèi)吞途徑鑒定
　　方法:
　　采用人跨膜轉(zhuǎn)運分子的小干擾RNA文庫篩選能夠抑制JEV感染人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞的宿主分子，并采用JEV假病毒系統(tǒng)鑒定參與JEV入侵的關(guān)鍵分子。聯(lián)合運

7、用針對不同細胞內(nèi)吞途徑的化學抑制劑作用、關(guān)鍵分子顯性抑制突變體的表達、激光共聚焦技術(shù)等分析JEV入侵所依賴的內(nèi)吞途徑。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)過JEV以及JEVpv兩輪篩選得到參與病毒入侵SK-N-SH細胞的一組宿主細胞分子。這些分子涵蓋了多個不同的功能蛋白種類，包括介導細胞內(nèi)吞的關(guān)鍵分子小窩蛋白1(Caveolin1)與發(fā)動蛋白2（Dynamin2）;細胞骨架肌動蛋白重排相關(guān)調(diào)節(jié)分子CFL1、PAK1、RAC1、RHOA、RO

8、CK2;信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)分子GRB2、PIK3C2G、PIK3CG;內(nèi)體分選與運輸調(diào)節(jié)分子RAB5A、RAB5C、VAPA;內(nèi)體酸化調(diào)節(jié)分子V-ATPase。對JEV內(nèi)吞途徑的分析表明JEV入侵依賴小窩介導的內(nèi)吞途徑，入侵過程可促進Caveolin1分子的磷酸化并與Caveolin1分子共定位。JEV內(nèi)吞依賴Dynamin2的作用，但JEV入侵不依賴網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑以及細胞巨胞飲作用。病毒內(nèi)吞入細胞后依賴Rab5功能但不依賴Rab

9、7功能。
　　結(jié)論:
　　JEV入侵SK-N-SH細胞途徑為小窩介導的發(fā)動蛋白2依賴型的內(nèi)吞途徑。其它內(nèi)吞途徑，如網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑以及巨胞飲作用不參與JEV對SK-N-SH細胞的入侵。JEV在內(nèi)吞入靶細胞后依賴Rab5的功能在胞內(nèi)運輸。
　　二、細胞骨架肌動蛋白調(diào)節(jié)乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細胞的機制
　　方法:
　　采用各Rho GTPase分子的干擾RNA、顯性抑制突變體、特異性化學抑制劑，以及聯(lián)合運用

10、免疫共沉淀、激光共聚焦等技術(shù)手段對細胞骨架肌動蛋白重排在JEV入侵SK-N-SH的作用環(huán)節(jié)與各分子的精細調(diào)節(jié)機制進行分析。
　　結(jié)果:
　　JEV入侵SK-N-SH細胞依賴細胞骨架的功能，能夠促進肌動蛋白的重排。JEV入侵依賴Rho GTPases家族RhoA與Rac1分子對肌動蛋白的調(diào)節(jié)作用而不依賴Cdc42分子。RhoA與Rac1分子均通過下游Cofilin分子調(diào)節(jié)肌動蛋白的重排。然而，RhoA與Rac1分子在JEV入侵

11、過程中的不同時間點發(fā)揮作用，JEV介導的RhoA激活早于Rac1分子。RhoA與Rac1分子在介導JEV入侵過程中發(fā)揮了不同的作用，RhoA激活促進caveolin1分子的磷酸化，而磷酸化的Caveolin1分子激活了Rac1從而促進了病毒的內(nèi)吞。對微管蛋白的作用分析發(fā)現(xiàn)微管主要在病毒內(nèi)化入細胞后發(fā)揮作用而不影響病毒內(nèi)化的過程。
　　結(jié)論:
　　Rho GTPase家族分子RhoA與Rac1通過兩步式的肌動蛋白重排調(diào)節(jié)機制介

12、導JEV入侵SK-N-SH細胞。
　　三、表皮生長因子受體在乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細胞中的作用及其機制
　　方法:
　　分別采用針對EGFR及其下游信號分子PI3K的化學抑制劑作用、RNA干擾、細胞因子作用，蛋白相互作用分析等實驗技術(shù)手段系統(tǒng)分析EGFR及PI3K/AKT信號通路在JEV參與入侵SK-N-SH細胞中的功能及調(diào)節(jié)機制。并采用激光共聚焦，免疫共沉淀等技術(shù)手段分析細胞膜脂筏在JEV入侵SK-N-SH細胞中的作用

13、。
　　結(jié)果:
　　酪氨酸酶抑制劑Genistein作用表明JEV入侵SK-N-SH細胞依賴酪氨酸激酶作用。JEV入侵可促進EGFR磷酸化作用，當下調(diào)EGFR或阻斷EGFR功能可抑制病毒入侵。動力學實驗表明EGFR參與JEV入侵的早期階段。阻斷EGFR及其下游PI3K/AKT信號通路均抑制了病毒介導的RhoA與Rac1的激活以及caveolin1分子磷酸化作用。病毒入侵促進了脂筏在細胞膜上的區(qū)域化聚集，MβCD/Filipi

14、n化學抑制劑可阻斷病毒入侵所依賴的信號通路的激活，從而阻斷病毒侵入SK-N-SH細胞。
　　結(jié)論:
　　EGFR-PI3K信號通路參與了JEV入侵的起始，EGFR通過其下游直接的效應通路PI3K/AKT信號調(diào)節(jié)了病毒入侵所依賴的RhoA與Rac1分子的激活以及后續(xù)病毒內(nèi)化所依賴的信號通路的激活。
　　小結(jié):
　　盡管JEV可以感染多種生物以及多種不同組織類型的細胞，對人類而言其最主要的威脅還在于感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，

15、引發(fā)腦炎。JEV侵入神經(jīng)細胞是乙腦發(fā)病的前提，JEV主要利用宿主細胞元件和內(nèi)吞機制侵入神經(jīng)細胞，這種入侵方式一方面幫助病毒跨過細胞膜以及擁擠的細胞質(zhì)等多道屏障到達病毒復制位點，另一方面以這種類似運輸貨物的方式侵入有助于病毒逃避宿主細胞免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。本課題在干擾RNA文庫篩選的基礎(chǔ)上系統(tǒng)研究了JEV入侵神經(jīng)細胞的途徑及調(diào)節(jié)機制。研究表明:(1)JEV通過小窩(Caveolin1)介導的，發(fā)動蛋白Dynamin2依賴型的內(nèi)吞途徑侵入SK-

16、N-SH細胞。(2)JEV入侵SK-N-SH細胞需要Rho GTPases家族成員RhoA以及Rac1介導的兩步肌動蛋白重排，RhoA通過調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架重排促進了Caveolin-1的磷酸化作用及其在胞膜上的聚集，從而形成利于病毒入胞的結(jié)構(gòu)區(qū)域;磷酸化的Caveolin-1引發(fā)了Rac1的激活，Rac1使得病毒通過Caveolin1介導的囊泡內(nèi)吞途徑入侵細胞。(3)EGFR-PI3K信號通路參與了JEV入侵的起始，介導了RhoA的