甲烷氧化菌素功能化納米金的銅配位組裝及擬酶活性.pdf

1、過氧化物酶(POD)可用于催化過氧化氫氧化有機(jī)化合物。天然POD在處理工業(yè)廢水、分析食品中微量酚、醫(yī)學(xué)臨床分析和合成酚類聚合物等許多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。目前應(yīng)用最廣泛的是辣根過氧化物酶(HRP)，天然HRP價(jià)格昂貴，而且容易失活，由于其分子較大，所以在酶聯(lián)免疫分析過程中，抗原和抗體很難結(jié)合，難以被標(biāo)記。因此在酶催化反應(yīng)中，尋找一種模擬酶和催化體系來代替HRP，并提高模擬酶催化反應(yīng)靈敏度是當(dāng)代科學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn)。本論文借助甲烷氧化菌素(Mb)

2、的銅配合物具有過氧化物酶活性及納米金大的比表面積和高的電子翻轉(zhuǎn)速度等特點(diǎn)，采用甲烷氧化菌素功能化納米金的銅配位組裝來設(shè)計(jì)合成高效POD模擬酶。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　利用甲基彎菌IMV（Methylosinus trichosporium IMV3011）產(chǎn)生的Mb，通過Cu(Ⅱ)添加過程中Mb的UV-可見光譜及熒光光譜變化，發(fā)現(xiàn)配合物中的配體4-羥基-5-硫酰咪唑(HTI)和4-硫酰-5羥基咪唑(THI)可能在金屬配合物的高氧化

3、態(tài)Mbn-Cu*穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用，推測(cè)Cu(Ⅱ)與Mb可能存在Mb-Cu、Mb2-Cu和Mb4-Cu三種不同的配位形式，并對(duì)三種配位形式的催化能力進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種Mb/Cu配合物都具有較強(qiáng)的過氧化物酶活性，而且Mb/Cu不同配位形式影響其酶活性，Kobs分別為6.11×10-4s-1，8.28×10-4s-1和4.16×10-4s-1，不同配位的反應(yīng)速率常數(shù)提高了400～800倍。其中過氧化物酶活性最高的是二配位，這可能

4、是因?yàn)镸b2-Cu配合物結(jié)構(gòu)可能更有利于在氧化劑作用下形成過渡態(tài)Mb2-Cu*，因此它活性表現(xiàn)為最高，由此確定Mb/Cu的最佳配位方式為Mb2-Cu。
　　利用Mb和Cu之間的不同金屬配位作用介導(dǎo)Mb功能化納米金粒子的組裝，構(gòu)建納米酶復(fù)合體系。向Mb修飾的納米金中加入適量Cu(Ⅱ)或Mb-Cu誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)Cu(Ⅱ)和Mb-Cu都在AuNPs表面形成了Mb2-Cu配位，這可能是由于Mb2-Cu形式的Cu(Ⅱ)和Mb之間具有高親和力。對(duì)

5、兩種組裝形式進(jìn)行過氧化物酶活性的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的Kobs比直接加入Cu(Ⅱ)或Mb-Cu時(shí)分別快3個(gè)和1個(gè)數(shù)量級(jí)，這說明納米金的高電子傳遞能力和納米簇中多活性中心產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)可以大大提高模擬酶的催化效率。在此基礎(chǔ)上，對(duì)Mb2-Cu穩(wěn)定的納米簇結(jié)構(gòu)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，確定了最佳反應(yīng)條件:最適pH為7.0，最適過氧化氫濃度為6×10-3mol/L，對(duì)苯二酚最適濃度為4×10-4mol/L，反應(yīng)溫度最適為70℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的納米酶比天

6、然POD穩(wěn)定性更高，符合一般生物催化劑的催化規(guī)律，可以用來作為天然POD的替代物。
　　主要對(duì)甲烷氧化菌素功能化納米金粒子的銅配位組裝進(jìn)行直接電化學(xué)研究，討論了掃速、pH、修飾時(shí)間等因素對(duì)酶修飾電極的影響，確定最佳電化學(xué)反應(yīng)條件。研究結(jié)果表明對(duì)于Mb2-Cu介導(dǎo)的納米金簇修飾電極，當(dāng)掃速在100mV/s，pH7.0，修飾時(shí)間16h時(shí)是修飾電極的最適組裝條件。對(duì)Mb2-Cu穩(wěn)定的納米金和Mb2-Cu介導(dǎo)的納米金簇修飾電極進(jìn)行計(jì)時(shí)電流

7、響應(yīng)測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種修飾電極在5.0×10-5～5.0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，電流與H2O2濃度之間線性關(guān)系良好，表觀米氏常數(shù)分別為0.805mmol/L和0.793mmol/L，該數(shù)值較小，說明兩種自組裝電極對(duì)于H2O2的還原都具有高親和力，對(duì)H2O2的檢出限分別為1.1×10-5mol/L和0.9×10-5mol/L。綜上所述，有理由認(rèn)為Mb2-Cu介導(dǎo)的納米金簇比Mb2-Cu穩(wěn)定的納米金具有更高的過氧化物酶催化活性，該結(jié)