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文檔簡介
1、隨著氣候變暖和近海的富營養(yǎng)化,全球海洋,包括我國近海水母爆發(fā)日益頻繁[1]。有毒水母傷人事件逐年上升,水母蜇傷成為最常見的海洋生物傷[2]。研究表明,水母毒素是一類結(jié)構(gòu)新穎的肽類毒素,相對分子質(zhì)量從10~600kDa不等。水母毒素的生物活性廣泛,包括心血管毒性、溶血毒性、神經(jīng)肌肉毒性與皮膚毒性等[3],其中心血管毒性是水母蜇傷致死的主要原因。
近年來有很多關(guān)于水母毒素心血管毒性研究的報道,但大多數(shù)仍以粗毒為研究對象。目前尚
2、無水母心血管毒性蛋白成功純化與鑒定的報道,這與水母毒素本身的特性有關(guān)。由于水母毒素不穩(wěn)定,易分解[4],在純化過程中活性喪失明顯,嚴(yán)重阻礙了其分離純化和作用機理的研究。水母毒素心血管毒性蛋白的分離純化已經(jīng)成為水母毒素研究的主要難點之一。
本論文以我國東海采集的代表性有毒水母——發(fā)形霞水母(Cyanea capillata, C. Capillata)為研究對象,第一步研究水母觸手提取物和刺絲囊毒素的制備方法,獲取合適的用于
3、心血管毒性蛋白分離純化的粗毒樣品;第二步通過測定所選樣品的毒性變化,確定在純化階段各組分活性監(jiān)測時的合適劑量,并分析常用緩沖液對純化樣品活性的影響,優(yōu)化純化過程中最佳緩沖液的選擇。第三步先用鹽析、超濾等方式預(yù)處理TOE,再綜合利用離子交換層析、凝膠過濾層析等色譜等方法進(jìn)行分離純化,利用心血管毒性檢測模型監(jiān)測各組分活性,聚丙烯凝膠電泳檢測活性組分中的蛋白成分;最后,利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)完成對分離
4、到的活性蛋白一級結(jié)構(gòu)的測定,并對它們的序列特點及生物活性進(jìn)行分析。
方法:
第一部分:觸手提取物和刺絲囊毒素的制備
經(jīng)過自溶、過濾、離心等步驟制備C. Capillata的觸手提取物(tentacle-only extract, TOE)和刺絲囊(nematocyst)。觀察不同自溶時間對觸手的自溶率和刺絲囊獲得量的影響。通過光學(xué)顯微鏡觀察C. Capillata刺絲囊的形態(tài)特點并進(jìn)行分析。比較
5、反復(fù)凍融、玻璃勻漿、組織破碎儀破碎等方式破碎刺絲囊囊壁制備刺絲囊毒素(Nematocyst venom, NV)的效果。測定并比較TOE和NV兩者心血管毒性和溶血活性,并通過SDS-PAGE比較兩者蛋白成分差異。綜合評定后確定用于后續(xù)分離純化的粗毒樣品。
第二部分:觸手提取物的毒性研究
改良寇氏法測定TOE對昆明種小鼠尾靜脈注射的LD50:取昆明種小鼠108只,雌雄各半,隨機分成9組,每組12只,禁食12 h
6、后按0.1ml/10g體重尾靜脈注射TOE,連續(xù)7 d密切觀察并記錄小鼠的攝食、行為、排泄物、中毒/死亡情況。Sprague-Dawley (SD)大鼠頸外靜脈插管給藥,股動脈插管監(jiān)測血壓變化分析不同濃度的TOE心血管毒性,完成TOE對SD大鼠致死臨界值Dt的初步測定,為后續(xù)純化組分活性測定提供給藥劑量參考。并將TOE浸沒在常用的幾種陰陽離子交換緩沖液過夜透析,測定其對大鼠心肌細(xì)胞的致死毒性。
第三部分:TOE的分離純化及
7、鑒定
先用硫酸銨沉淀和超濾的方式預(yù)處理TOE,除去大量的雜蛋白,得出可能的目標(biāo)蛋白的分子量范圍,然后以BioLogic DuoFlow (Bio-Rad公司)和?KTA Purifier(GE Healthcare)蛋白純化系統(tǒng)為主要技術(shù)平臺,綜合利用凝膠過濾、離子交換層析等多種方法,分離純化C. Capillata TOE粗毒。SD大鼠頸外靜脈插管給藥、股動脈插管監(jiān)測血壓變化來分析各組分心血管毒性,SDS-PAGE分析各
8、組分蛋白成分,進(jìn)一步指導(dǎo)心血管毒性組分的分離純化。得到目標(biāo)蛋白的單一條帶后利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)完成對其一級結(jié)構(gòu)的測定,并對它們的序列特點及可能存在的生物活性進(jìn)行初步分析。
結(jié)果:
第一部分:觸手提取物和刺絲囊毒素的制備
通過自溶、過濾、離心等方式能成功分離得到C. Capillata的觸手提取物和刺絲囊。水母觸手不同的自溶時間會影響觸手的溶解率。在觸手
9、自溶實驗中,0h組是以超聲破碎的方式幫助觸手自溶,2 h組玻璃棒不間斷攪拌,所以這兩組未溶解的觸手的量較4~48 h組要少一些,同樣得到的刺絲囊的量要多一些。48 h、96 h (m/v, 1:1)、96 h (m/v, 1:2)以及96 h (m/v, 1:3)幾組未溶的觸手較少。在96 h (m/v, 1:1)獲得的刺絲囊質(zhì)量最多。綜上所述,發(fā)形霞水母觸手自溶的最佳條件為:在觸手質(zhì)量與無菌海水體積比為1:1的環(huán)境中自溶96 h。刺絲
10、囊的顯微鏡觀察結(jié)果顯示刺絲囊包含兩個部分:刺絲囊囊腔和內(nèi)部的刺絲。C. Capillata刺絲囊從形狀上可分為香蕉形和橢圓形,以香蕉形為主。在提取NV過程中,反復(fù)凍融對刺絲囊囊壁的破壞較小,而采用玻璃勻漿器勻漿的方式能有效破碎大部分刺絲囊,獲得NV。TOE和NV兩者均具有較強的溶血活性,溶血活性劑量曲線呈“S”形。在心血管毒性方面,相同劑量的TOE的活性要明顯強于NV。TOE和NV的電泳結(jié)果顯示,TOE蛋白條帶比NV的蛋白條帶多且明顯。
11、
第二部分:觸手提取物的毒性研究
測得TOE對昆明種小鼠尾靜脈注射的LD50劑量為4.244 mg/kg,95%的可信限為3.679 mg/kg-4.862 mg/kg,小鼠的癥狀呈現(xiàn)劑量依耐性。低劑量組(<5 mg/kg)小鼠表現(xiàn)為精神萎靡、四肢乏力、行動遲緩、蜷縮等癥狀,部分小鼠于48 h內(nèi)死亡,死亡動物解剖,肉眼觀察小鼠的肺呈鮮紅色,有水腫、淤血等癥狀;心臟略腫大。超過48 h未死亡者逐漸恢復(fù)至正常狀態(tài)
12、,連續(xù)觀察7 d,小鼠攝食、活動和大小便均正常,無特殊分泌物,處死動物解剖肉眼觀察,主要臟器未見異常。中劑量組(5~10mg/kg)小鼠表現(xiàn)為精神萎靡、四肢乏力、行動遲緩,部分出現(xiàn)肌顫、蜷縮等癥狀,早期還伴隨著呼吸加深、加快表現(xiàn),隨著時間延長逐漸減弱,最后出現(xiàn)陳-施式呼吸而死亡,死亡時間大約在2 h左右。死亡動物解剖,肉眼觀察肺出現(xiàn)水腫、淤血等癥狀,心臟基本正常。高劑量組(>10mg/kg)小鼠迅速出現(xiàn)呼吸加深、加快表現(xiàn),1min左右逐
13、步出現(xiàn)全身性肌顫、雙下肢抽搐、全身性驚厥、角弓反張等中樞神經(jīng)系統(tǒng)典型癥狀。小鼠大多在5 min內(nèi)死亡,死亡時伴有大小便失禁。死亡動物解剖,肉眼觀察肺和心臟基本正常。
TOE對SD大鼠致死估計臨界值Dt約為0.8 mg/kg。靜脈注射TOE后30s內(nèi)會迅速產(chǎn)生一個輕微而短暫的升血壓反應(yīng),而后伴隨著劇烈的血壓下降。0.7 mg/kg劑量組的大鼠在1min至2 min期間血壓下降最明顯,5 min左右血壓達(dá)到最低值(約40mmH
14、g)。隨著時間的推移,血壓逐漸恢復(fù),30min后基本穩(wěn)定,可恢復(fù)至80mmHg左右。0.8 mg/kg劑量組的大鼠在0.5 min至2 min期間血壓下降明顯,2 min后血壓繼續(xù)下降,持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)部分大鼠血壓會逐漸的恢復(fù)至70mmHg左右,另有部分大鼠則在20min左右死亡。0.9 mg/kg劑量組的大鼠1min至2 min期間血壓下降明顯,伴隨著劇烈的抽搐,血壓持續(xù)下降,20min至40min期間陸續(xù)死亡。以此估計,TOE對SD大鼠
15、致死估計臨界值Dt約為0.8 mg/kg。
第三部分:TOE的分離純化及鑒定
使用硫酸銨沉淀法和超濾法處理C. Capillata TOE,初步鎖定一27 kDa的蛋白為可能的心血管毒性組分。再通過陰陽離子交換色譜柱及凝膠過濾色譜柱進(jìn)一步對毒素進(jìn)行分離純化,最終確定27 kDa的條帶蛋白是C. Capillata TOE中存在的心血管毒性蛋白,并利用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)解析27 kDa條帶蛋白的一級結(jié)構(gòu)
16、。
結(jié) 論
C. Capillata TOE具有與NV相當(dāng)或略強于NV的心血管毒性。相比較而言,TOE的制備較NV的制備操作簡單,且可獲得的樣品量大,是分離純化心血管毒性蛋白的合適樣品。
TOE具有很強的毒性,對昆明種小鼠尾靜脈注射的半數(shù)致死劑量(LD50)為4.244 mg/kg,對SD大鼠的致死估計臨界值Dt值約為0.8 mg/kg。
采用鹽析、超濾以及離子交換等方法純化TOE
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