發(fā)形霞水母觸手提取物的分離純化及其活性研究.pdf

1、隨著氣候變暖和近海的富營(yíng)養(yǎng)化，全球海洋，包括我國(guó)近海水母爆發(fā)日益頻繁[1]。有毒水母?jìng)耸录鹉晟仙蛤貍蔀樽畛Ｒ?jiàn)的海洋生物傷[2]。研究表明，水母毒素是一類結(jié)構(gòu)新穎的肽類毒素，相對(duì)分子質(zhì)量從10～600kDa不等。水母毒素的生物活性廣泛，包括心血管毒性、溶血毒性、神經(jīng)肌肉毒性與皮膚毒性等[3]，其中心血管毒性是水母蜇傷致死的主要原因。
　　 近年來(lái)有很多關(guān)于水母毒素心血管毒性研究的報(bào)道，但大多數(shù)仍以粗毒為研究對(duì)象。目前尚

2、無(wú)水母心血管毒性蛋白成功純化與鑒定的報(bào)道，這與水母毒素本身的特性有關(guān)。由于水母毒素不穩(wěn)定，易分解[4]，在純化過(guò)程中活性喪失明顯，嚴(yán)重阻礙了其分離純化和作用機(jī)理的研究。水母毒素心血管毒性蛋白的分離純化已經(jīng)成為水母毒素研究的主要難點(diǎn)之一。
　　 本論文以我國(guó)東海采集的代表性有毒水母——發(fā)形霞水母(Cyanea capillata, C. Capillata)為研究對(duì)象，第一步研究水母觸手提取物和刺絲囊毒素的制備方法，獲取合適的用于

3、心血管毒性蛋白分離純化的粗毒樣品；第二步通過(guò)測(cè)定所選樣品的毒性變化，確定在純化階段各組分活性監(jiān)測(cè)時(shí)的合適劑量，并分析常用緩沖液對(duì)純化樣品活性的影響，優(yōu)化純化過(guò)程中最佳緩沖液的選擇。第三步先用鹽析、超濾等方式預(yù)處理TOE，再綜合利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等色譜等方法進(jìn)行分離純化，利用心血管毒性檢測(cè)模型監(jiān)測(cè)各組分活性，聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)活性組分中的蛋白成分；最后，利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)完成對(duì)分離

4、到的活性蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，并對(duì)它們的序列特點(diǎn)及生物活性進(jìn)行分析。
　　 方法：
　　 第一部分：觸手提取物和刺絲囊毒素的制備
　　 經(jīng)過(guò)自溶、過(guò)濾、離心等步驟制備C. Capillata的觸手提取物(tentacle-only extract, TOE)和刺絲囊(nematocyst)。觀察不同自溶時(shí)間對(duì)觸手的自溶率和刺絲囊獲得量的影響。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察C. Capillata刺絲囊的形態(tài)特點(diǎn)并進(jìn)行分析。比較

5、反復(fù)凍融、玻璃勻漿、組織破碎儀破碎等方式破碎刺絲囊囊壁制備刺絲囊毒素（Nematocyst venom, NV）的效果。測(cè)定并比較TOE和NV兩者心血管毒性和溶血活性，并通過(guò)SDS-PAGE比較兩者蛋白成分差異。綜合評(píng)定后確定用于后續(xù)分離純化的粗毒樣品。
　　 第二部分：觸手提取物的毒性研究
　　 改良寇氏法測(cè)定TOE對(duì)昆明種小鼠尾靜脈注射的LD50：取昆明種小鼠108只，雌雄各半，隨機(jī)分成9組，每組12只，禁食12 h

6、后按0.1ml/10g體重尾靜脈注射TOE，連續(xù)7 d密切觀察并記錄小鼠的攝食、行為、排泄物、中毒/死亡情況。Sprague-Dawley (SD)大鼠頸外靜脈插管給藥，股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)血壓變化分析不同濃度的TOE心血管毒性，完成TOE對(duì)SD大鼠致死臨界值Dt的初步測(cè)定，為后續(xù)純化組分活性測(cè)定提供給藥劑量參考。并將TOE浸沒(méi)在常用的幾種陰陽(yáng)離子交換緩沖液過(guò)夜透析，測(cè)定其對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的致死毒性。
　　 第三部分：TOE的分離純化及

7、鑒定
　　 先用硫酸銨沉淀和超濾的方式預(yù)處理TOE，除去大量的雜蛋白，得出可能的目標(biāo)蛋白的分子量范圍，然后以BioLogic DuoFlow (Bio-Rad公司)和?KTA Purifier（GE Healthcare）蛋白純化系統(tǒng)為主要技術(shù)平臺(tái)，綜合利用凝膠過(guò)濾、離子交換層析等多種方法，分離純化C. Capillata TOE粗毒。SD大鼠頸外靜脈插管給藥、股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)血壓變化來(lái)分析各組分心血管毒性，SDS-PAGE分析各

8、組分蛋白成分，進(jìn)一步指導(dǎo)心血管毒性組分的分離純化。得到目標(biāo)蛋白的單一條帶后利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)完成對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，并對(duì)它們的序列特點(diǎn)及可能存在的生物活性進(jìn)行初步分析。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：觸手提取物和刺絲囊毒素的制備
　　 通過(guò)自溶、過(guò)濾、離心等方式能成功分離得到C. Capillata的觸手提取物和刺絲囊。水母觸手不同的自溶時(shí)間會(huì)影響觸手的溶解率。在觸手

9、自溶實(shí)驗(yàn)中，0h組是以超聲破碎的方式幫助觸手自溶，2 h組玻璃棒不間斷攪拌，所以這兩組未溶解的觸手的量較4～48 h組要少一些，同樣得到的刺絲囊的量要多一些。48 h、96 h (m/v, 1:1)、96 h (m/v, 1:2)以及96 h (m/v, 1:3)幾組未溶的觸手較少。在96 h (m/v, 1:1)獲得的刺絲囊質(zhì)量最多。綜上所述，發(fā)形霞水母觸手自溶的最佳條件為：在觸手質(zhì)量與無(wú)菌海水體積比為1:1的環(huán)境中自溶96 h。刺絲

10、囊的顯微鏡觀察結(jié)果顯示刺絲囊包含兩個(gè)部分：刺絲囊囊腔和內(nèi)部的刺絲。C. Capillata刺絲囊從形狀上可分為香蕉形和橢圓形，以香蕉形為主。在提取NV過(guò)程中，反復(fù)凍融對(duì)刺絲囊囊壁的破壞較小，而采用玻璃勻漿器勻漿的方式能有效破碎大部分刺絲囊，獲得NV。TOE和NV兩者均具有較強(qiáng)的溶血活性，溶血活性劑量曲線呈“S”形。在心血管毒性方面，相同劑量的TOE的活性要明顯強(qiáng)于NV。TOE和NV的電泳結(jié)果顯示，TOE蛋白條帶比NV的蛋白條帶多且明顯。

11、
　　 第二部分：觸手提取物的毒性研究
　　 測(cè)得TOE對(duì)昆明種小鼠尾靜脈注射的LD50劑量為4.244 mg/kg，95％的可信限為3.679 mg/kg-4.862 mg/kg，小鼠的癥狀呈現(xiàn)劑量依耐性。低劑量組（<5 mg/kg）小鼠表現(xiàn)為精神萎靡、四肢乏力、行動(dòng)遲緩、蜷縮等癥狀，部分小鼠于48 h內(nèi)死亡，死亡動(dòng)物解剖，肉眼觀察小鼠的肺呈鮮紅色，有水腫、淤血等癥狀；心臟略腫大。超過(guò)48 h未死亡者逐漸恢復(fù)至正常狀態(tài)

12、，連續(xù)觀察7 d，小鼠攝食、活動(dòng)和大小便均正常，無(wú)特殊分泌物，處死動(dòng)物解剖肉眼觀察，主要臟器未見(jiàn)異常。中劑量組（5～10mg/kg）小鼠表現(xiàn)為精神萎靡、四肢乏力、行動(dòng)遲緩，部分出現(xiàn)肌顫、蜷縮等癥狀，早期還伴隨著呼吸加深、加快表現(xiàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱，最后出現(xiàn)陳-施式呼吸而死亡，死亡時(shí)間大約在2 h左右。死亡動(dòng)物解剖，肉眼觀察肺出現(xiàn)水腫、淤血等癥狀，心臟基本正常。高劑量組（>10mg/kg）小鼠迅速出現(xiàn)呼吸加深、加快表現(xiàn)，1min左右逐

13、步出現(xiàn)全身性肌顫、雙下肢抽搐、全身性驚厥、角弓反張等中樞神經(jīng)系統(tǒng)典型癥狀。小鼠大多在5 min內(nèi)死亡，死亡時(shí)伴有大小便失禁。死亡動(dòng)物解剖，肉眼觀察肺和心臟基本正常。
　　 TOE對(duì)SD大鼠致死估計(jì)臨界值Dt約為0.8 mg/kg。靜脈注射TOE后30s內(nèi)會(huì)迅速產(chǎn)生一個(gè)輕微而短暫的升血壓反應(yīng)，而后伴隨著劇烈的血壓下降。0.7 mg/kg劑量組的大鼠在1min至2 min期間血壓下降最明顯，5 min左右血壓達(dá)到最低值（約40mmH

14、g）。隨著時(shí)間的推移，血壓逐漸恢復(fù)，30min后基本穩(wěn)定，可恢復(fù)至80mmHg左右。0.8 mg/kg劑量組的大鼠在0.5 min至2 min期間血壓下降明顯，2 min后血壓繼續(xù)下降，持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)部分大鼠血壓會(huì)逐漸的恢復(fù)至70mmHg左右，另有部分大鼠則在20min左右死亡。0.9 mg/kg劑量組的大鼠1min至2 min期間血壓下降明顯，伴隨著劇烈的抽搐，血壓持續(xù)下降，20min至40min期間陸續(xù)死亡。以此估計(jì)，TOE對(duì)SD大鼠

15、致死估計(jì)臨界值Dt約為0.8 mg/kg。
　　 第三部分：TOE的分離純化及鑒定
　　 使用硫酸銨沉淀法和超濾法處理C. Capillata TOE，初步鎖定一27 kDa的蛋白為可能的心血管毒性組分。再通過(guò)陰陽(yáng)離子交換色譜柱及凝膠過(guò)濾色譜柱進(jìn)一步對(duì)毒素進(jìn)行分離純化，最終確定27 kDa的條帶蛋白是C. Capillata TOE中存在的心血管毒性蛋白，并利用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)解析27 kDa條帶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)

16、。
　　 結(jié) 論
　　 C. Capillata TOE具有與NV相當(dāng)或略強(qiáng)于NV的心血管毒性。相比較而言，TOE的制備較NV的制備操作簡(jiǎn)單，且可獲得的樣品量大，是分離純化心血管毒性蛋白的合適樣品。
　　 TOE具有很強(qiáng)的毒性，對(duì)昆明種小鼠尾靜脈注射的半數(shù)致死劑量（LD50）為4.244 mg/kg，對(duì)SD大鼠的致死估計(jì)臨界值Dt值約為0.8 mg/kg。
　　 采用鹽析、超濾以及離子交換等方法純化TOE