寬體金線蛭提取物初步分離純化及其抗氧化活性研究.pdf

1、水蛭作為一味傳統(tǒng)的藥材有廣泛的醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用，以往對水蛭的研究主要集中在其抗凝血活性、抗血栓等活性上，而很少見對水蛭抗氧化活性的研究。本論文采取硫酸銨分段鹽析與CMSepharose FF陽離子交換層析等方法對寬體金線蛭蛋白及短肽提取物進行初步分離純化，并以清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基活性為指標，研究寬體金線蛭蛋白及短肽提取物的抗氧化活性。主要研究結(jié)果如下。
　　1.比較寬體金線蛭鮮品與凍干品的抗氧化活性
　

2、　采用濃度為0.9％的生理鹽水提取寬體金線蛭鮮品與凍干品粗蛋白，分別測定其清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基活性。結(jié)果顯示，凍干品三種清除自由基活性均強于鮮品，并且凍干品與鮮品清除羥基自由基、ABTS自由基的活性均好于抗壞血酸陽性對照組，但其清除超氧陰離子自由基活性較抗壞血酸差。
　　2.寬體金線蛭蛋白提取物抗氧化活性
　　采用生理鹽水提取寬體金線蛭蛋白，分別用硫酸銨分段鹽析、CMSepharose FF陽離子

3、交換層析對水蛭粗蛋白進行初步分離純化，并篩選活性較強的部分(硫酸銨分段鹽選擇0-30%、70%-100%部分，CMSepharose FF陽離子交換層析選擇3、4號峰)，測定各活性部分的三種清除自由基活性。結(jié)果顯示，分段鹽析后0-30%部分清除羥基自由基活性強于抗壞血酸，但清除超氧陰離子自由基、ABTS自由基活性不及抗壞血酸，70%-100%部分三種清除自由基活性均不及抗壞血酸。而經(jīng)CMSepharose FF分離后，3、4號峰清除三種

4、自由基活性均明顯高于抗壞血酸，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。
　　3.寬體金線蛭酶解液抗氧化活性
　　采用三水平四因素正交試驗，用木瓜蛋白酶酶解寬體金線蛭，以肽含量為指標，確定最佳酶解工藝即加酶量7500U/g，酶解溫度40℃，料液比1:4(W/V),酶解時間4h，最初pH8.5。CMSepharose FF陽離子交換層析對寬體金線蛭短肽進行初步分離純化，并測定其原液及分離純化后活性較強部分(2、3號峰)的三種清除自由基活性。結(jié)果

5、顯示，酶解原液三種清除自由基活性均弱于抗壞血酸，但經(jīng)CMSepharose FF分離后，各組分清除羥基自由基、ABTS自由基活性均明顯強于抗壞血酸，但其清除超氧陰離子自由基活性弱于抗壞血酸。經(jīng)Sephadex G-25對CMSepharose FF組分脫鹽后，用Q-TOF測定活性強的組分的分子量分布主要集中在130.96Da~330.34Da范圍內(nèi)。
　　4.寬體金線蛭蛋白及多肽提取物均有較好的抗氧化活性，并且經(jīng)CMSepharo

6、se FF分離純化后期抗氧化活性均明顯提高，較抗壞血酸對照組強；水蛭肽的活性較水蛭蛋白稍弱。
　　在采用硫酸銨初步分離水蛭蛋白時，A(0-30%)顯示出較好的清除羥基自由基及清除ABTS+自由基能力，A、C(70%-100%)的抗氧化能力都較B(30%-70%)強，與之前研究水蛭抗凝血活性時，往往選用B段進行研究有所不同；另外，與以往文獻報道的采用Q-sepha rose FF、DEAE等陰離子交換層析分離水蛭抗凝血成分不同，本文