豬牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白提取物的分離純化及活性檢測.pdf

1、牙齒的發(fā)育及牙胚的細(xì)胞分化是一系列口腔上皮和外胚層間充質(zhì)組織細(xì)胞間相互作用的結(jié)果。牙本質(zhì)形成過程中，成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化、成熟，分泌基質(zhì)，以及誘導(dǎo)羥基磷灰石晶體沉積，都是由多種基質(zhì)蛋白相互影響共同參與完成。牙本質(zhì)有機(jī)基質(zhì)決定其形態(tài)并且是礦物形成的基本物質(zhì)。有機(jī)基質(zhì)主要是膠原，非膠原基質(zhì)約占10％，它在牙本質(zhì)的生物礦化過程中起著模板和調(diào)節(jié)作用。目前對(duì)非膠原蛋白的研究大多集中在單一蛋白質(zhì)的生物特性，但仍沒有發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)形成的核心蛋白，對(duì)于非膠原

2、蛋白的混合作用研究不多。本研究采用組織蛋白提取方法從牙本質(zhì)蛋白中獲得DMPCs，并利用體外實(shí)驗(yàn)初步檢測混合蛋白相互作用對(duì)hDPSC生長的影響，觀察其生物活性。
　　1、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白的提取和分離純化
　　取六齡豬上下頜磨牙牙胚，4℃進(jìn)行蛋白分離，磨碎后采用EDTA/鹽酸胍浸泡提取牙本質(zhì)蛋白，浸泡提取7d后取上清，分別標(biāo)記并加以濃縮，利用ATKA蛋白純化分析儀分離純化蛋白質(zhì)，經(jīng)PBS透析后濃縮以備用。經(jīng)SDS-PAGE電泳圖譜

3、檢測，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)遷移率的關(guān)系，可以計(jì)算出相對(duì)分子質(zhì)量分別為:96Kda、38Kda、20Kda以及小分子，其中20Kda的染色條帶最重。與文獻(xiàn)中常見DSP、DPP相對(duì)分子量接近。說明EDTA提取法能夠提取到多種非膠原蛋白，同時(shí)分子量檢測證實(shí)能夠建立一條穩(wěn)定提取DMPCs的方法。
　　2、DMPCs對(duì)hDPSC生長的影響
　　設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：使培養(yǎng)基內(nèi)DMPCs終末濃度分別為50μg/ml、100μg/mL、150

4、μg/ml、200μg/ml，并以2％FCS的DMEM培養(yǎng)液作對(duì)照組，利用MTT法、ALP法分別檢測DMPCs對(duì)hDPSC生長的影響。結(jié)果顯示，1d、3d時(shí)100μg/ml促進(jìn)hDPSC增殖的能力與對(duì)照組比較有顯著差異（P<0.05），5d作用不明顯，結(jié)合hDPSC生長曲線考慮是生長飽和所致。從線性關(guān)系上分析，DMPCs對(duì)hDPSC的作用是呈遞進(jìn)關(guān)系的，提示一定濃度的DMPCs可以促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖，在牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化