Munc13-1 MUN結(jié)構(gòu)域在突觸囊泡啟動過程中的作用機制研究.pdf

1、突觸囊泡的分泌過程以SNARE蛋白syntaxin-1，SNAP-25，synaptobrevin組裝成致密的四螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)合物為核心機制，同時受到Munc18-1以及Munc13-1等多種蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。本課題綜合運用X-射線晶體學(xué)、生物化學(xué)以及體外膜重建、電生理等實驗技術(shù)，深入研究了Munc13-1重要功能片段MUN結(jié)構(gòu)域調(diào)控突觸囊泡分泌啟動過程的功能機制，結(jié)果如下：
　　獲得了大鼠Munc13-1MUN結(jié)構(gòu)域三維晶體結(jié)構(gòu)。設(shè)計

2、Munc13-1MUN結(jié)構(gòu)域包括A、B、C、D全部四個亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)片段MUN933，并獲得MUN933分辨率為2.9的晶體結(jié)構(gòu)。MUN結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)呈一系列α-螺旋束排列形成的狹長拱形，其中部亞結(jié)構(gòu)域B同C接合處存在一個高度保守的疏水口袋。
　　鑒定了大鼠Munc13-1MUN結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)syntaxin-1打開作用的關(guān)鍵活性位點。在以Munc18-1–syntaxin-1復(fù)合物起始的SNARE復(fù)合物組裝以及SNARE復(fù)合物組裝介導(dǎo)的

3、體外膜融合體系中，位于疏水口袋的高度保守氨基酸Asn1128、Phe1131（NF）突變后導(dǎo)致Munc13-1MUN結(jié)構(gòu)域失去催化打開Munc18-1–syntaxin-1復(fù)合物的活性。
　　證明了UNC-13-Munc13MUN結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵活性位點在突觸囊泡啟動過程中的重要調(diào)控作用。在成年秀麗隱桿線蟲體壁肌肉的神經(jīng)肌肉連接頭（NMJs）處記錄興奮性突觸后電流（EPSC），MUN結(jié)構(gòu)域NF位點對于自發(fā)和誘發(fā)性釋放至關(guān)重要，突變后導(dǎo)致

4、NMJs突觸囊泡無法啟動。
　　此前，UNC-13-Munc13MUN結(jié)構(gòu)域是神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中唯一缺少三維結(jié)構(gòu)的基本要素，本課題獲得并解析出的大鼠Munc13-1蛋白完整且具活性的MUN結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)填補了這一空白，為UNC-13-Munc13s在突觸囊泡分泌過程中的作用機制研究提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。發(fā)現(xiàn)UNC-13-Munc13MUN結(jié)構(gòu)域催化打開syntaxin-1同時促進SNARE復(fù)合物組裝介導(dǎo)的膜融合的關(guān)鍵活性位點，并證明該活性