果蠅Neurexin調(diào)控突觸囊泡募集和釋放的機(jī)制研究.pdf

1、突觸的形成、發(fā)育、成熟是一個高度復(fù)雜和動態(tài)的過程，突觸囊泡作為神經(jīng)遞質(zhì)的運(yùn)載體在神經(jīng)元之間的信號傳遞中扮演著十分重要的作用。干擾突觸囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放將導(dǎo)致大腦功能的異常，引發(fā)一系列的神經(jīng)疾病。之前關(guān)于突觸囊泡與突觸前膜接近，錨定，融合以及釋放等過程已經(jīng)研究的很多。研究發(fā)現(xiàn)許多突觸相關(guān)分子參與這一過程的調(diào)控，例如Synaptotagmins，Synapsins，Synaptobrevins和Munc18等。大量的研究同樣顯示，突

2、觸囊泡運(yùn)載著神經(jīng)遞質(zhì)沿著骨架分子在軸突中轉(zhuǎn)運(yùn)，到達(dá)突觸末端形成不同的囊泡池，靠近突觸前膜準(zhǔn)備釋放的叫做準(zhǔn)備釋放池(RRP)，遠(yuǎn)離突觸前膜供應(yīng)釋放的叫做儲存池(RP)。這些特異的結(jié)構(gòu)對于正常的神經(jīng)遞質(zhì)釋放是必須的。然而，突觸囊泡是如何募集到突觸的特定區(qū)域，維持正常的神經(jīng)信號傳遞的，目前還不清楚。研究表明突觸粘附分子Neurexin(NRX)和Neuroligin(NLG)在突觸前后膜上相互作用形成異源的二聚體，它們在突觸的形成、發(fā)育、成熟

3、、可塑性等過程中扮演著十分重要的作用。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)nrx和nlg基因的突變與自閉癥等精神疾病存在關(guān)聯(lián)。已有的研究闡述了NRX參與調(diào)控突觸的結(jié)構(gòu)和功能，但是其中涉及到的詳細(xì)的分子機(jī)制并不清楚。本文利用果蠅的神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)為模型，研究果蠅NRX(DNRX)參與調(diào)控囊泡的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，突觸末端分布以及釋放等過程的分子機(jī)制，進(jìn)一步揭示NRX在突觸中的重要功能。
　　NRX是一類一次跨膜的神經(jīng)細(xì)胞粘附分子，它廣泛表達(dá)在中樞以及外周神經(jīng)系

4、統(tǒng)。本文的研究發(fā)現(xiàn)在體缺失DNRX導(dǎo)致突觸末端囊泡彌散分布以及自發(fā)狀態(tài)下囊泡釋放頻率增高。為了研究DNRX調(diào)控突觸囊泡分布以及釋放的分子機(jī)制，首先在dnrx突變體背景下，用actin組裝相關(guān)分子挽救囊泡缺陷的表型，結(jié)果顯示DNRX是通過F-actin調(diào)控突觸囊泡的募集和釋放。同時，利用生物化學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)了一種抑癌基因編碼的蛋白Scribble通過它的四個PDZ結(jié)構(gòu)域和DNRX的PDZ結(jié)合位點(diǎn)直接的相互作用。另外，結(jié)果顯示Scribbl

5、e可以作為一座橋梁介導(dǎo)DNRX和Dpix之間的連接。Dpix是一個Rac/Cdc42特異的鳥苷酸交換因子，它可以通過激活Rac1促進(jìn)actin的聚集。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DNRX是通過PDZ結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控突觸囊泡的募集和釋放，我們構(gòu)建了缺失PDZ結(jié)合位點(diǎn)（缺失C末端7個氨基酸）的DNRX的轉(zhuǎn)基因果蠅(DNRX△PDZ)。發(fā)現(xiàn)在dnrx突變體背景下，突觸前過表達(dá)DNRX△PDZ卻不能挽救dnrx突變體中F-actin和突觸囊泡缺陷的表型。最后，檢

6、測了野生型，dnrx突變體以及DNRX和Scribble下調(diào)后活性形式的Rac1(Rac1-GTP)的水平，結(jié)果顯示缺失或下調(diào)DNRX和Scribble都將導(dǎo)致Rac1-GTP水平降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Rac1參與DNRX對突觸前F-actin和突觸囊泡的調(diào)控，將功能異常的Rac1(dominant nagetive Rac1，Rac1DN)整合到dnrx突變體背景下，通過突觸前過表達(dá)觀察能否挽救dnrx突變體中觀察到的表型缺陷。免疫染色