miR-34b-VAMP2通路在鉛暴露影響突觸囊泡形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、鉛是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物，長(zhǎng)期處于低劑量的鉛暴露環(huán)境下可以造成人體多個(gè)器官的功能異常，其中對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響尤為明顯。處在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的兒童是鉛中毒的易感人群，鉛在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異常蓄積可導(dǎo)致兒童學(xué)習(xí)、記憶能力明顯下降、認(rèn)知障礙和發(fā)育遲緩等一系列癥狀。許多研究都建立了發(fā)育期鉛暴露的大鼠模型，并且都把研究重點(diǎn)集中在鉛暴露對(duì)海馬及相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶的影響。
　　學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)主要是通過(guò)突觸可塑性所實(shí)現(xiàn)的，突觸傳遞的改變?cè)谕?/p>

2、觸可塑性中至關(guān)重要，而神經(jīng)傳遞主要通過(guò)突觸胞吐發(fā)揮功能?？扇苄訬SF附著蛋白受體（SNARE）復(fù)合物是神經(jīng)元胞吐過(guò)程重要的一部分，它主要參與調(diào)節(jié)突觸前膜融合過(guò)程。突觸小泡膜蛋白2（vesicle-associated membrane protein2,VAMP2）是 SNARE復(fù)合物的重要組成部分，分布于囊泡膜上，突觸小體相關(guān)蛋白（synaptosomal associated protein of molecular mass25k

3、D,SNAP25）及突觸融合相關(guān)蛋白（syntaxin）分布在突觸前膜上，三者共同構(gòu)成 SNARE蛋白，在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中發(fā)揮重要的作用。
　　MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)約為22個(gè)核苷酸左右的小單鏈RNA家族，它通過(guò)與靶基因互補(bǔ)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)其降解或抑制翻譯發(fā)揮作用。研究表明microRNA在大腦中豐富表達(dá)，它可能參與維持正常腦神經(jīng)功能和動(dòng)態(tài)平衡，如學(xué)習(xí)記憶，神經(jīng)元分化，突觸可塑性和神經(jīng)生成等功能。

4、也有報(bào)道在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，共濟(jì)失調(diào)，亨廷頓氏病和精神分裂癥miRNA也有差異性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室利用microRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)發(fā)育期鉛暴露可導(dǎo)致大鼠海馬中miR-34b等microRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，提示包括miR-34b在內(nèi)的microRNA分子可能參與了鉛神經(jīng)毒性作用，但是其具體機(jī)制并不清楚。
　　本研究是實(shí)驗(yàn)室前期工作的延續(xù)，以發(fā)育期大鼠、大鼠腎嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞為

5、實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究鉛暴露誘導(dǎo)miR-34b表達(dá)的改變及其調(diào)節(jié)突觸小泡膜蛋白VAMP2表達(dá)的作用，并探討miR-34b調(diào)節(jié)VAMP2表達(dá)在鉛影響突觸囊泡生成中的作用，研究結(jié)果將為闡明鉛神經(jīng)毒性的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。
　　目的：
　　本研究通過(guò)建立發(fā)育期大鼠慢性鉛暴露模型以及PC12細(xì)胞、HT22細(xì)胞鉛暴露模型，研究鉛暴露對(duì)miR-34b及其潛在靶分子 VAMP2表達(dá)的影響，探討miR-34b調(diào)節(jié)VAMP2表達(dá)的機(jī)制及其在鉛影響突

6、觸囊泡生成中的作用，闡明miR-34b/VAMP2通路在鉛神經(jīng)毒性中的作用，為揭示鉛神經(jīng)毒性的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.建立鉛暴露的動(dòng)物模型和細(xì)胞模型。
　?、賱?dòng)物模型：21日齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、100ppm鉛暴露組和300ppm鉛暴露組，每組12只，飲水染鉛8周。
　　②細(xì)胞模型：采用大鼠腎嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞和小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞，鉛暴露濃度為0、5、10μmol/L

7、。
　　2.采用Morris水迷宮方法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　3.采用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR方法檢測(cè)對(duì)miR-34b和靶蛋白突觸小泡膜蛋白vamp2mRNA的表達(dá)水平；采用Western blot方法檢測(cè)VAMP2蛋白的表達(dá)水平。
　　4.采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-34b對(duì)vamp2 mRNA3’-UTR區(qū)穩(wěn)定性的影響。
　　5.通過(guò)在PC12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34b inhibitor

8、檢測(cè)其對(duì)靶分子VAMP2mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　6.采用免疫電鏡技術(shù)觀察發(fā)育期鉛暴露對(duì)大鼠海馬突觸小泡膜蛋白VAMP2表達(dá)水平的影響。
　　7.采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)鉛暴露對(duì)PC12細(xì)胞VAMP2蛋白表達(dá)的影響。
　　8.采用透射電鏡技術(shù)檢測(cè)發(fā)育期鉛暴露對(duì)大鼠海馬突觸囊泡形成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.發(fā)育期鉛暴露影響大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力
　　利用原子吸收分光光度儀進(jìn)行血鉛濃度測(cè)定，結(jié)果顯

9、示鉛暴露組大鼠血鉛水平隨著暴露時(shí)間及劑量增加顯著升高。Morris水迷宮結(jié)果顯示，鉛暴露組與對(duì)照相比逃避潛伏期明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；撤除平臺(tái)后，穿越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組相比較少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　2.鉛暴露影響miR-34b的表達(dá)
　　實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)顯示，鉛暴露組大鼠海馬組織中miR-34b表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且300ppm鉛暴露

10、組高于100ppm鉛暴露組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。在體外實(shí)驗(yàn)中鉛暴露影響PC12細(xì)胞和HT22細(xì)胞中miR-34b的表達(dá)，且表達(dá)水平隨著染鉛劑量的增加而升高（p＜0.05）。
　　3.miR-34b調(diào)控突觸小泡膜蛋白VAMP2的表達(dá)
　　采用生物信息學(xué)方法對(duì) miR-34b的靶基因進(jìn)行分析，通過(guò)三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站Targetscan、picTar和miRNA.org等對(duì)miR-34b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出突觸

11、小泡膜蛋白VAMP2作為miR-34b靶分子的可能性較大。
　　通過(guò)在PC12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34b的抑制劑，利用qRT-PCR和Western blot方法觀察靶分子VAMP2的表達(dá)，結(jié)果顯示 VAMP2顯著升高，說(shuō)明miR-34b能夠調(diào)節(jié)vamp2 mRNA的表達(dá)水平。熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)顯示，miR-34b能夠與vamp2 mRNA的3‘-UTR區(qū)特異結(jié)合影響其穩(wěn)定性。
　　4.鉛暴露通過(guò)miR-34b/VAMP

12、2通路影響大鼠海馬區(qū)突觸囊泡的形成
　　實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，鉛暴露組大鼠海馬組織中vamp2 mRNA及VAMP2蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組下降。與對(duì)照組相比，PC12細(xì)胞和HT22細(xì)胞處理24h和48h后，vamp2mRNA表達(dá)水平下降，VAMP2蛋白表達(dá)水平也低于對(duì)照組。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)顯示，鉛暴露后PC12細(xì)胞中VAMP2蛋白表達(dá)水平降低。
　　透射電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)育期鉛暴露能

13、夠顯著減少大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)突觸囊泡的數(shù)量；免疫電鏡方法檢測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)育期鉛暴露后海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)內(nèi)VAMP2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.鉛暴露可以影響大鼠海馬組織、PC12細(xì)胞及HT22細(xì)胞miR-34b的表達(dá)。
　　2.miR-34b調(diào)控突觸小泡膜蛋白vamp2 mRNA的穩(wěn)定性。
　　3.鉛暴露通過(guò)誘導(dǎo)miR-34b表達(dá)進(jìn)而影響下游靶分子突觸小泡膜蛋白VAMP2的表達(dá)以及海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)突觸囊泡的