軟骨分化過程中的microRNA的功能研究.pdf

1、骨質(zhì)性關(guān)節(jié)炎是人群中高發(fā)的骨骼疾病，其表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的降解和結(jié)構(gòu)的破壞。關(guān)節(jié)軟骨與胚胎發(fā)育過程中的軟骨細胞是同一來源的，都是由間質(zhì)祖細胞聚集分化而來。隨著 microRNA在脊椎動物發(fā)育中的作用被發(fā)現(xiàn)與報道，在軟骨化過程中的相關(guān) microRNA研究成為了骨骼發(fā)育與骨關(guān)節(jié)炎病理研究的新一熱點。近年來，已有關(guān)于軟骨分化過程中的相關(guān)microRNA研究報道，但對軟骨分化和關(guān)節(jié)炎病理發(fā)生中特異性調(diào)控的microRNA了解仍然并不充分。本文旨在

2、通過對軟骨分化過程的microRNA差異化芯片分析尋找該過程中特異調(diào)控的功能性microRNA，并探究其在軟骨發(fā)育中的調(diào)控機制與功能。
　　本文實驗通過體外原代培養(yǎng)鼠 E12.5肢芽細胞，對其軟骨化過程與Wnt/β-catenin信號誘導(dǎo)的非軟骨化過程進行差異化對比芯片分析，發(fā)現(xiàn)了miR-140、miR-140*、miR-455在軟骨分化過程中特異表達；miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206肌肉相關(guān)的mic

3、roRNA在Wnt/β-catenin信號誘導(dǎo)作用下高量表達。隨后，通過 RT-PCR、RACE、原位雜交等實驗，本文發(fā)現(xiàn)miR-140，miR-140*的初始轉(zhuǎn)錄本通過內(nèi)含子保留形式特異在軟骨發(fā)生過程中表達，并與其宿主基因Wwp2-C共表達。Wwp2-C基因在軟骨中的特異性表達以及蛋白編碼能力在本文中首次被報道與驗證。為了探求miR-140/140*表達的特異性，本文通過對克隆的miR-140/140*初始轉(zhuǎn)錄本的啟動子區(qū)域進行熒光素

4、酶激活實驗以及與軟骨特異性轉(zhuǎn)錄因子 Sox9的ChIP實驗，發(fā)現(xiàn) Sox9通過與-200bp堿基位點的直接結(jié)合激活了miR-140在軟骨發(fā)生中特異表達。接著，本文進一步在軟骨發(fā)生中探究miR-140的功能，利用RCAS::miR-140-Sponge病毒在雞胚肢芽細胞中特異性抑制miR-140在軟骨發(fā)生中的功能，發(fā)現(xiàn)miR-140對于維持軟骨發(fā)生過程中的細胞增殖過程是必須的。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測以及分子生物學(xué)驗證，本文發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)控基因

5、Sp1是miR-140在軟骨發(fā)生過程中的一個靶基因。
　　綜上所述，本文通過對軟骨發(fā)生過程與Wnt誘導(dǎo)的非軟骨化過程的microRNA差異對比分析發(fā)現(xiàn)miR-140特異表達于軟骨發(fā)生中，它與宿主基因Wwp2-C共表達并受到轉(zhuǎn)錄因子Sox9的直接誘導(dǎo)，在軟骨發(fā)生中它通過對細胞周期調(diào)控蛋白 Sp1的直接靶向作用維持軟骨細胞增殖。以上研究拓展了軟骨發(fā)生過程中的microRNA功能研究，為microRNA在骨骼發(fā)育過程中的作用提供了新的機