miR-125a在破骨細胞分化過程中的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分hsa-mir-125a在破骨細胞分化過程中的作用研究
　　目的:
　　研究hsa-mir-125a在破骨細胞分化過程中所發(fā)揮的作用
　　方法:
　?、袤w外培養(yǎng)CD14+PBMCs，用RANKL聯(lián)合M-CSF誘導其向破骨細胞分化，提取誘導前和誘導后不同時間點的細胞總RNA，采用RT-PCR法檢測分化過程中hsa-mir-125a的表達模式。②在miRBase數(shù)據(jù)庫中獲得hsa-mir-125a的前體序列p

2、re-mir-125a，用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體合成hsa-mir-125a的表達載體pre-mir-125a，同時合成2'甲氧基修飾的hsa-mir-125a反義miRNA(anti-mir-125a)，并將pre-mir-125a、anti-mir-125a或其各自的陰性對照載體(miR-C)分別轉(zhuǎn)染CD14+PBMCs，轉(zhuǎn)染后加入RANKL和M-CSF共同誘導細胞分化。③轉(zhuǎn)染誘導后，用RT-PCR法檢測細胞

3、中hsa-mir-125a表達水平的變化。④在轉(zhuǎn)染誘導后第6天，提取細胞總RNA，檢測破骨細胞特異性標記TRAP、NFATc1的mRNA水平，同時收集細胞行TRAP染色實驗觀察破骨細胞分化情況。
　　結(jié)果:
　?、僭谡T導CD14+PBMCs向破骨細胞分化過程中，隨著誘導時間的延長，hsa-mir-125a的表達逐漸減少。
　?、谑褂胮cDNA6.2-GW/EmGFP-miR成功構(gòu)建了hsa-mir-125a的表達載體p

4、re-mir-125a，其轉(zhuǎn)染的CD14+PBMCs能在細胞中高表達 hsa-mir-125a。
　?、踙sa-mir-125a高表達能降低破骨細胞分化特異性指標TRAP、NFATc1的mRNA水平，減少TRAP陽性多核巨細胞的形成;而抑制hsa-mir-125a的表達后，TRAP、NFATc1的mRNA水平相應(yīng)提高，TRAP染色陽性的多核巨細胞形成也較對照組明顯增加。
　　結(jié)論:
　　hsa-mir-125a在破骨細

5、胞分化過程中表達逐漸降低。過表達hsa-mir-125a可以抑制破骨細胞分化，而阻遏hsa-mir-125a的表達則促進破骨細胞分化。
　　第二部分hsa-mir-125a調(diào)控破骨細胞分化的機制研究
　　目的:
　　尋找hsa-mir-125a在破骨細胞分化過程中作用的靶基因，探究hsa-mir-125a與其靶基因在調(diào)控破骨細胞分化過程中的相互作用機制。
　　方法:
　　①利用三種常用的靶基因預(yù)測軟件預(yù)測h

6、sa-mir-125a可能作用的靶基因，結(jié)合hsa-mir-125a在破骨細胞分化過程中的功能，在預(yù)測結(jié)果交集中篩選出TRAF6基因為潛在的靶基因。②根據(jù)hsa-mir-125a在TRAF6基因3'UTR結(jié)合位點的堿基序列構(gòu)建野生型熒光素酶報告載體WT-pGL3-TRAF6-3'UTR和突變型熒光素酶報告載體MUT-pGL3-TRAF6-3'UTR。將這兩個載體分別與pre-mir-125a或?qū)φ蛰d體(miR-C)交叉共轉(zhuǎn)染CD14+P

7、BMCs后，檢測載體的熒光素酶活性變化，驗證TRAF6確為hsa-mir-125a作用的靶基因。③用pre-mir-125a單獨轉(zhuǎn)染CD14+PBMCs，RT-PCR和Western Blotting法分別檢測TRAF6基因的mRNA和蛋白的表達水平變化。
　　結(jié)果:
　?、侔谢蝾A(yù)測軟件預(yù)測出TRAF6為hsa-mir-125a作用的靶基因。
　?、诮徊婀厕D(zhuǎn)染細胞后檢測熒光素酶活性，pre-mir-125a和WT-p

8、GL3-TRAF6-3'UTR共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶報告基因活性明顯受到抑制，而pre-mir-125a和MUT-pGL3-TRAF6-3'UTR共轉(zhuǎn)染組、miR-C和MUT-pGL3-TRAF6-3'UTR共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶報告基因活性均無明顯變化。
　?、蹎为氜D(zhuǎn)染pre-mir-125a可以抑制TRAF6蛋白表達水平，而對TRAF6 mRNA水平無影響。
　　結(jié)論:
　　通過靶基因軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實的