利用轉(zhuǎn)錄組和16S測(cè)序技術(shù)評(píng)價(jià)Bt蛋白對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)安全性的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因作物對(duì)非靶標(biāo)生物的影響是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。龜紋瓢蟲(chóng)是棉田的優(yōu)勢(shì)捕食性天敵，不僅捕食棉田中多種害蟲(chóng)，還取食棉花花粉，是評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花環(huán)境安全的重要指示性非靶標(biāo)昆蟲(chóng)。本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)研究了Bt蛋白對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)解毒、消化基因的表達(dá)量和對(duì)共生微生物組成和結(jié)構(gòu)的影響。本研究旨在明確Bt蛋白對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)的安全性，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)和安全管理提供技術(shù)支撐和依據(jù)。本研究獲得以下主要研究結(jié)果。
　　1、選擇未

2、取食蚜蟲(chóng)的龜紋瓢蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)，分別用合有500μg/ml Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1Ac+Cry2Ab蛋白的2mol/L蔗糖水處理1齡期龜紋瓢蟲(chóng)48h，以蔗糖水處理為對(duì)照，利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)龜紋瓢蟲(chóng)體內(nèi)解毒和消化相關(guān)基因的表達(dá)量變化。結(jié)果表明，高濃度Bt蛋白對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)體內(nèi)解毒基因CarE、P450、GST、CCE和消化基因APN、CP、TPs的表達(dá)量沒(méi)有顯著影響。
　　2、選擇未取食蚜蟲(chóng)的龜紋瓢蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)，分別

3、用含有500μg/ml Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1Ac+Cry2Ab蛋白的2mol/L蔗糖水處理1齡期龜紋瓢蟲(chóng)48h，以蔗糖水處理為對(duì)照，利用Illumma Hiseq平臺(tái)的高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)龜紋瓢蟲(chóng)體內(nèi)共生菌的結(jié)構(gòu)和組成。結(jié)果表明，葡萄球菌屬Staphylococcus、肉桿菌屬Carnobacterium雙歧桿菌屬Bifidobacteium、芽孢桿菌屬Bacllus、布赫納氏菌Buchnera為優(yōu)勢(shì)菌屬。葡萄球菌屬Sta

4、phylococcus在取食過(guò)Cry2Ab和Cry1Ac蛋白的龜紋瓢蟲(chóng)體內(nèi)豐度增大。Cry1Ac+Cry2Ab處理的龜紋瓢蟲(chóng)體內(nèi)肉桿菌屬、雙歧桿菌屬豐度相對(duì)增大。但整體上優(yōu)勢(shì)共生菌的結(jié)構(gòu)和組成無(wú)明顯差異。
　　3、選擇取食蚜蟲(chóng)的龜紋瓢蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)，分別用Cry2Ab蛋白含量為0、100μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml的2mol/L蔗糖水和豌豆蚜隔天飼養(yǎng)至四齡末期。以單一取食蚜蟲(chóng)的龜

5、紋瓢蟲(chóng)為對(duì)照組。稱(chēng)量4齡龜紋瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)的蟲(chóng)重，調(diào)查單對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)三天的產(chǎn)卵量。結(jié)果表明，Cry2Ab蛋白對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)的蟲(chóng)重和產(chǎn)卵量沒(méi)有顯著影響。高通量檢測(cè)龜紋瓢蟲(chóng)體內(nèi)優(yōu)勢(shì)共生菌的組成和多樣性。主要的菌門(mén)是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，豐度都高達(dá)80％以上。葡萄球菌屬（Staphylococcus）的豐度分別為8368％、9639％、9536％、83.72％、93.72％、9845％、8480％，為龜紋瓢蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)菌屬。結(jié)果表明:Bt蛋白不影

6、響龜紋瓢蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)共生菌;不同濃度的Bt蛋白優(yōu)勢(shì)共生菌一致;Bt蛋白對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)的體重和產(chǎn)卵量沒(méi)有顯著影響。
　　4、選擇取食蚜蟲(chóng)的龜紋瓢蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)，用0(T)、500μg/ml(BL)Cry2Ab蛋白的2mol/L蔗糖水和豌豆蚜分別間隔喂養(yǎng)至幼蟲(chóng)的4個(gè)不同齡期（1d/1d=蚜蟲(chóng)/Bt）。只取食蚜蟲(chóng)的不同齡期龜紋瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)為對(duì)照組YC。酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)結(jié)果表明Bt蛋白在蔗糖水中穩(wěn)定存在。高通量檢測(cè)各齡期龜紋瓢蟲(chóng)體內(nèi)共生菌的組成

7、和結(jié)構(gòu)。葡萄球菌屬（Staphylococcus）為龜紋瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)4個(gè)齡期的優(yōu)勢(shì)菌屬，是常住菌屬。T組中，葡萄球菌屬在4個(gè)齡期的豐度分別為94.11％、7527％、9409％、93.71％;BL組中，葡萄球菌屬在4個(gè)齡期的豐度分別為78.02％、96.75％、83.38％、71.74％;YC組中，葡萄球菌屬在4個(gè)齡期的豐度分別為16.14％、83.04％、80.04％、84.80％。結(jié)果表明:龜紋瓢蟲(chóng)體內(nèi)存在Cry2Ab蛋白;龜紋瓢蟲(chóng)幼蟲(chóng)