利用體外培養(yǎng)細胞系評價外源蛋白安全性的研究.pdf

1、隨著轉基因技術的日趨成熟，已經能夠將外源基因準確的導入到各種動植物體進行重組表達，獲得人們想要的性狀。該插入的特定的外源基因，要么是一種調控序列，要么編碼一種蛋白質,許多轉基因作物是通過外源基因表達的特定蛋白質實現(xiàn)人們的期望的。在轉基因作物進入市場之前，需要徹底評價它們的安全性。目前，沒有一個統(tǒng)一確定的實驗用于預測外源蛋白質的安全性。相比于在體模型的復雜性，利用體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)初步評價安全性具有許多優(yōu)點，如低成本、速度快、減少動物的使用

2、，并且能獲得很好的效果，能夠研究誘導細胞的毒性機制，從建立的細胞系獲得的結果可重復性好。這些優(yōu)點使體外模型受到廣泛的研究。
　　方法：選擇蓖麻子蛋白代替外源蛋白，用其處理人外周血B淋巴細胞，蓖麻子蛋白濃度范圍0~100 ng/mL，在6 h、12 h用CCK-8試劑檢測細胞的相對增殖率，研究對細胞的劑量-時間效應，并且確定其12 h的半數(shù)抑制濃度。添加接近半數(shù)抑制濃度蓖麻子蛋白20 ng/mL處理細胞，在2 h、6 h、10 h、

3、12 h時間段檢測TNF-α、CD40、IL-1β及Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表達情況，通過檢測免疫相關基因及凋亡相關基因的表達情況，研究用基因表達變化評價外源蛋白安全可行性；采用彗星實驗，分析試驗組和對照組遺傳毒性方面的差異；用 AO/EB雙熒光染色法和流式細胞術檢測兩組間細胞凋亡情況。根據實驗情況，得出評價結論。
　　結果和結論：與對照組相比，在6 h誘導時間內，試驗組細胞毒性在較低劑量（10~40 ng/mL

4、）會提高細胞相對活力，40 ng/mL以上表現(xiàn)抑制作用。12 h結果為隨著濃度的增高，細胞相對活力越來越低，毒性作用越來越明顯，表明毒性作用呈現(xiàn)一定的劑量-時間效應?；虮磉_的結果顯示，試驗組TNF-α、CD40基因表達顯著升高。使用彗星實驗檢測遺傳毒性，試驗組尾部DNA百分比、OTM顯著增高，兩組結果差異顯著。在檢測凋亡實驗中，試驗組凋亡率隨著濃度和時間的增加而升高。故可以通過使用IM-9細胞系檢測細胞相對增殖率、TNF-α和CD40