利用體外培養(yǎng)細(xì)胞系評價(jià)外源蛋白安全性的研究.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟，已經(jīng)能夠?qū)⑼庠椿驕?zhǔn)確的導(dǎo)入到各種動植物體進(jìn)行重組表達(dá)，獲得人們想要的性狀。該插入的特定的外源基因，要么是一種調(diào)控序列，要么編碼一種蛋白質(zhì),許多轉(zhuǎn)基因作物是通過外源基因表達(dá)的特定蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)人們的期望的。在轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入市場之前，需要徹底評價(jià)它們的安全性。目前，沒有一個(gè)統(tǒng)一確定的實(shí)驗(yàn)用于預(yù)測外源蛋白質(zhì)的安全性。相比于在體模型的復(fù)雜性，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)初步評價(jià)安全性具有許多優(yōu)點(diǎn)，如低成本、速度快、減少動物的使用

2、，并且能獲得很好的效果，能夠研究誘導(dǎo)細(xì)胞的毒性機(jī)制，從建立的細(xì)胞系獲得的結(jié)果可重復(fù)性好。這些優(yōu)點(diǎn)使體外模型受到廣泛的研究。
　　方法：選擇蓖麻子蛋白代替外源蛋白，用其處理人外周血B淋巴細(xì)胞，蓖麻子蛋白濃度范圍0~100 ng/mL，在6 h、12 h用CCK-8試劑檢測細(xì)胞的相對增殖率，研究對細(xì)胞的劑量-時(shí)間效應(yīng)，并且確定其12 h的半數(shù)抑制濃度。添加接近半數(shù)抑制濃度蓖麻子蛋白20 ng/mL處理細(xì)胞，在2 h、6 h、10 h、

3、12 h時(shí)間段檢測TNF-α、CD40、IL-1β及Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表達(dá)情況，通過檢測免疫相關(guān)基因及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，研究用基因表達(dá)變化評價(jià)外源蛋白安全可行性；采用彗星實(shí)驗(yàn)，分析試驗(yàn)組和對照組遺傳毒性方面的差異；用 AO/EB雙熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組間細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，得出評價(jià)結(jié)論。
　　結(jié)果和結(jié)論：與對照組相比，在6 h誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)，試驗(yàn)組細(xì)胞毒性在較低劑量（10~40 ng/mL

4、）會提高細(xì)胞相對活力，40 ng/mL以上表現(xiàn)抑制作用。12 h結(jié)果為隨著濃度的增高，細(xì)胞相對活力越來越低，毒性作用越來越明顯，表明毒性作用呈現(xiàn)一定的劑量-時(shí)間效應(yīng)。基因表達(dá)的結(jié)果顯示，試驗(yàn)組TNF-α、CD40基因表達(dá)顯著升高。使用彗星實(shí)驗(yàn)檢測遺傳毒性，試驗(yàn)組尾部DNA百分比、OTM顯著增高，兩組結(jié)果差異顯著。在檢測凋亡實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)組凋亡率隨著濃度和時(shí)間的增加而升高。故可以通過使用IM-9細(xì)胞系檢測細(xì)胞相對增殖率、TNF-α和CD40