AMPK信號通路在熱誘導豬睪丸支持細胞緊密連接蛋白表達中的作用.pdf

1、熱應激（heat stress，HS）指動物對熱環(huán)境的舒適區(qū)上限溫度所產(chǎn)生的一系列生理反應。隨著溫室效應的加劇，夏季持續(xù)高溫引起的熱應激嚴重影響了家畜的繁殖性能，對畜牧業(yè)造成的損失越來越嚴重。因此研究熱應激對家畜繁殖性能的影響對于減少夏季熱應激對動物的不良影響，提高經(jīng)濟效益具有十分重要的意義。豬皮下脂肪較厚，汗腺不發(fā)達，其體內(nèi)熱量較難通過皮膚蒸發(fā)，因此豬很不耐熱。公豬對環(huán)境溫度尤其敏感，高溫環(huán)境可對公豬的生殖性能產(chǎn)生明顯影響，引起精液量

2、減少、精子活力降低、精子畸形率升高。盡管冷凍精液技術(shù)已有相當長的歷史，但豬冷凍精液由于繁殖成績不理想未得到大面積應用，因此夏季熱應激引起公豬生精能力降低對整個養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生的影響較難通過使用冷凍精液而改善。全面、深入地研究熱應激對公豬精子發(fā)生過程的影響，可為預防和緩解熱應激對公豬繁殖性能的影響提供重要的理論依據(jù)。
　　支持細胞間的緊密連接是構(gòu)成血睪屏障的重要結(jié)構(gòu)，在精子發(fā)生過程中起了關鍵性的作用。它將生精上皮分為基底室和近腔室。細線前

3、期精母細胞必須穿過緊密連接結(jié)構(gòu)進入近腔室才能完成減數(shù)分裂過程進而分化為成熟的精子。此外，其屏障作用為精子發(fā)生提供了穩(wěn)定的微環(huán)境。熱應激可引起緊密連接相關蛋白表達下調(diào)及表達異位，從而破壞緊密連接結(jié)構(gòu)。目前關于熱應激對緊密連接影響的報道多為在體實驗，體外實驗也多聚焦于成熟的體外培養(yǎng)的支持細胞，但未成熟的支持細胞內(nèi)緊密連接相關蛋白是否表達、表達部位如何以及熱應激對未成熟支持細胞內(nèi)緊密連接蛋白的作用均未見報道。盡管熱應激可通過改變成熟支持細胞內(nèi)

4、緊密連接相關蛋白的表達進而影響精子發(fā)生，但由于支持細胞間緊密連接是逐步形成的，熱應激對未成熟的支持細胞內(nèi)緊密連接相關蛋白的影響也可能影響成熟后血睪屏障的形成。鑒于此，本文以仔豬睪丸支持細胞為研究對象，探究熱應激對未成熟的支持細胞內(nèi)緊密連接蛋白表達的影響，并解析其中的分子機制。
　　AMPK是真核細胞內(nèi)能量代謝調(diào)節(jié)的關鍵分子，同時也參與調(diào)節(jié)上皮細胞間緊密連接的功能：AMPK的激活可促進緊密連接形成，敲除AMPK則可導致緊密連接功能喪

5、失，但AMPK對睪丸內(nèi)緊密連接的調(diào)控作用未見報道。另外，熱應激常引起細胞內(nèi)氧化應激水平升高，使細胞遭受氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)ROS可通過調(diào)節(jié)AMPK上游調(diào)控分子CaMKKβ的表達量進而調(diào)節(jié)AMPK的活性。基于以上研究背景，本研究提出假設：熱應激使支持細胞發(fā)生氧化應激反應，進而通過抑制AMPK信號通路調(diào)控緊密連接相關蛋白的表達。本文所得研究結(jié)果如下：
　　1.支持細胞體外HS模型的建立及HS對緊密連接相關蛋白表達的影響
　　首先比

6、較兩種熱處理方法（43℃水浴30 min與43℃氣浴30 min）對支持細胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)氣浴法可引起支持細胞活力發(fā)生可逆性下降（降低34.46％， P<0.01），而隨著恢復時間的延長，其活力在48 h可恢復至正常；水浴法亦可引起細胞活力降低（降低57.94%，P<0.01），但至熱處理后第48 h，活力進一步降低為對照組的29.49%，因此選擇43℃氣浴30 min作為支持細胞體外熱處理模型。利用此模型發(fā)現(xiàn)，熱處理可通過降低線粒體

7、膜電位顯著增加支持細胞早期凋亡率（增加367.87%，P<0.01），撤除熱處理后，隨著時間的延長，支持細胞早期凋亡率逐漸降低并恢復至正常。
　　利用 western blotting及熒光定量 PCR對緊密連接相關蛋白（Claudin-11、JAM-A、Occludin、ZO-1）及mRNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)四種蛋白均能在體外培養(yǎng)的未成熟的公豬支持細胞內(nèi)表達；熱處理后緊密連接相關蛋白的mRNA及蛋白水平顯著下調(diào)；撤除熱處理后隨著時間

8、的延長，緊密連接相關蛋白表達量逐漸恢復。通過免疫熒光技術(shù)對 Claudin-11在支持細胞內(nèi)的表達部位進行檢測，發(fā)現(xiàn)盡管體外培養(yǎng)的支持細胞間未形成緊密連接結(jié)構(gòu)，但 Claudin-11大量表達于支持細胞胞膜、胞質(zhì)及囊泡膜上，且表達呈彌散型。熱處理后 Claudin-11僅少量表達于囊泡膜上，撤除熱處理后48 h，Claudin-11在支持細胞內(nèi)的表達可得到恢復。以上結(jié)果表明：熱處理可引起支持細胞內(nèi)緊密連接相關蛋白的mRNA及蛋白水平發(fā)生

9、可逆性下調(diào)，并使Claudin-11的表達部位發(fā)生變化。
　　2.AMPK信號通路在HS影響緊密連接相關蛋白表達中的作用
　　本研究首先發(fā)現(xiàn)熱處理可抑制AMPK活性，使AMPK磷酸化水平降低60.04%（P<0.01），而這一變化可隨恢復時間延長逐漸恢復。隨后對AMPK上游調(diào)控因子（ATP、CaMKKβ、LKB1）進行檢測，發(fā)現(xiàn)熱處理后支持細胞內(nèi)ATP水平降低為對照組的48.92%（P<0.01），CaMKKβ表達量下調(diào)為對

10、照組的46.18%（P<0.01），而LKB1活性未見變化。利用CaMKKβ的特異性抑制劑STO609（10μmol/L，2 h）對CaMKKβ進行抑制，發(fā)現(xiàn)可在熱處理后進一步抑制AMPK活性，相比于單獨熱處理組下降62.19%（P<0.01），而STO609單獨作用卻對AMPK活性無明顯影響，說明熱處理通過抑制CaMKKβ的表達進而抑制AMPK的活性。
　　為了進一步探究 AMPK在熱處理下調(diào)緊密連接相關蛋白表達中是否發(fā)揮作用，

11、本研究利用AMPK特異性激活劑AICAR（2 mmol/L，2 h）處理支持細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先激活AMPK再進行熱處理，緊密連接相關蛋白表達量的下降幅度明顯減??；隨后利用過表達載體pcDNA-AMPK/siRNA對AMPK進行過表達/干涉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達 AMPK可部分挽救熱處理引起的緊密連接相關蛋白表達下調(diào)。免疫熒光結(jié)果表明，熱處理后Claudin-11在支持細胞中的定位也在AMPK被激活或過表達后發(fā)生變化，從僅表達于囊泡膜表面變?yōu)閺?/p>

12、散于胞質(zhì)、胞膜及囊泡膜表面。而干涉 AMPK后再行熱處理，緊密連接相關蛋白表達量較單獨熱處理組進一步下調(diào)，且Claudin-11在支持細胞內(nèi)幾乎檢測不到。這說明CaMKKβ介導的AMPK在熱處理調(diào)控緊密連接相關蛋白表達中起了關鍵作用。
　　3.氧化應激在HS調(diào)控緊密連接相關蛋白表達中的作用
　　熱處理后支持細胞內(nèi)ROS及MDA水平顯著上調(diào)，而抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性在熱處理后顯著降低。隨著熱處理后恢復時間的延

13、長，以上指標均逐漸恢復至正常水平。這表明熱處理可使支持細胞內(nèi)氧化應激水平升高。
　　通過提前添加抗氧化劑 NAC（N-acetyl-L-cysteine，N-乙酰半胱氨酸），發(fā)現(xiàn)NAC（1 mmol/L，2 h）通過降低熱處理后支持細胞內(nèi)ROS及MDA水平，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT的活性，從而減輕熱處理后支持細胞的氧化損傷。同時，NAC的添加亦可降低支持細胞在熱處理后的早期凋亡率，進而提高熱處理后支持細胞的活性。本

14、研究進一步發(fā)現(xiàn) NAC可上調(diào)熱處理后支持細胞內(nèi) CaMKKβ表達量，并提高AMPK的活性，結(jié)果說明熱處理通過ROS的產(chǎn)生抑制CaMKKβ的表達，進而抑制 AMPK活性。最后本研究還發(fā)現(xiàn) NAC的添加可有效緩解熱處理引起的緊密連接相關蛋白表達下調(diào)和Claudin-11在細胞內(nèi)異位。
　　綜上所述，熱處理通過提高支持細胞內(nèi)氧化應激水平，抑制CaMKKβ的表達，進而抑制AMPK活性，從而引起緊密連接相關蛋白表達和在細胞中的定位發(fā)生可逆性