視網(wǎng)膜新生血管形成時緊密連接蛋白Claudins表達(dá)的時空變化的研究.pdf

1、Claudins是近年發(fā)現(xiàn)的一個多基因家族，至今已發(fā)現(xiàn)超過24個家族成員，Claudins蛋白被認(rèn)為是形成緊密連接的骨架。在不同的組織和不同的病理生理狀態(tài)下，Claudins家族成員的表達(dá)與分布有明顯變化，屏障功能相應(yīng)改變，而已有的關(guān)于他們的研究主要集中在上皮組織中。新生血管生長是糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼部血管性疾病的主要病理特征和嚴(yán)重并發(fā)癥，原有的血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的緊密連接的破壞和/或視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接屏障發(fā)育不完善引起滲

2、漏、出血、和/或水腫等，進(jìn)而導(dǎo)致患者嚴(yán)重視力損害。迄今為止，關(guān)于Claudins在視網(wǎng)膜組織及病理性視網(wǎng)膜新生血管上的研究甚少。因此，本研究首先研究了正常小鼠視網(wǎng)膜中Claudins的mRNA和蛋白表達(dá)與分布，然后以氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型為主要方法，檢測了視網(wǎng)膜新生血管生成時Claudins表達(dá)的時空變化。
　　 第一部分正常小鼠視網(wǎng)膜組織中緊密連接蛋白Claudins的表達(dá)與分布研究
　　 目的：探討正常小鼠視網(wǎng)膜組織中

3、緊密連接蛋白Claudins的表達(dá)與分布特點(diǎn)。
　　 方法：取出生后第18天(P18)正常小鼠視網(wǎng)膜和6周齡成年小鼠視網(wǎng)膜、腎臟和腦組織提取RNA，用RT-PCR檢測緊密連接蛋白Claudins的mRNA表達(dá)水平。提取P8、11、13、15、18和21天小鼠視網(wǎng)膜組織RNA，實時熒光定量RT-PCR檢測視網(wǎng)膜發(fā)育過程中Claudins mRNA表達(dá)的動態(tài)變化。P18小鼠眼球冰凍切片免疫熒光染色檢測緊密連接蛋白Claudin-1～

4、-5，-7，-12和-23在視網(wǎng)膜的分布，P18小鼠免疫熒光視網(wǎng)膜全層鋪片檢測Claudin-1、-2和-5在視網(wǎng)膜深、淺層血管的表達(dá)與分布。
　　 結(jié)果：在正常P18天和6周齡成年小鼠視網(wǎng)膜組織中均能檢測到多種Claudins基因mRNA水平的表達(dá)。其中表達(dá)最高的是Claudin-5、-12和-23，其次是Claudin-1～-４、-7、-9、-10、-11、-19、-20和-22，與P18小鼠相比，6周齡成年小鼠中Claud

5、in-1、-2、-4、-9和-19表達(dá)降低，而Claudin-18表達(dá)增高。作為陽性對照標(biāo)本的6周齡小鼠腎臟和腦組織中檢測到多種Claudins的表達(dá)，但四種組織中均未檢測到Claudin-6的表達(dá)。在正常小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中，mRNA表達(dá)變化超過2倍的有Claudin-1～-5、-7、-12，-14～-17，-22和-23。P18小鼠冰凍切片免疫熒光染色顯示Claudin-1、-2、-4和-5均分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、內(nèi)叢狀層(

6、IPL)和外叢狀層(OPL)，Claudin-4的分布與IsolectinB4沒有共定位，而Claudin-1、-2和-5均與IsolectinB4呈共定位分布。Claudin-3和-23僅在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中檢測到表達(dá)，Claudin-12僅分布在外叢狀層，Claudin-3、-12和-23均不與IsolectinB4呈共定位分布。視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光未檢測到Claudin-7的表達(dá)。視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光染色顯示P18小鼠視網(wǎng)膜深層淺層血

7、管網(wǎng)上均有Claudin-1、-2和-5的表達(dá)，呈線性均勻分布。
　　 結(jié)論：從P8至P21，伴隨視網(wǎng)膜的發(fā)育，Claudin-1、-2、-3、-4、-5、-12和-23的mRNA呈先增高后降低的動態(tài)表達(dá)趨勢，其中Claudin-1、-2和-5分布在視網(wǎng)膜深淺兩層各級血管上，對于血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障功能具有重要作用，而不分布在血管上的Claudin-3、-4、-12和-23則可能對視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)育具有重要作用。
　　 第二部分

8、Claudins在氧誘導(dǎo)的小鼠血管增殖性視網(wǎng)膜病變中的差異表達(dá)
　　 目的：探討OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成時血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的功能狀態(tài)以及Claudins表達(dá)和分布的特點(diǎn)。
　　 方法：用C57BL/6J乳鼠建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)模型，于出生后7天將乳鼠隨同母鼠放入含氧體積分?jǐn)?shù)為75％的養(yǎng)箱中飼養(yǎng)5天，P12放回到正常大氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5天。于P18行FITC-Dextran心臟灌注及伊文思藍(lán)腹腔注射視網(wǎng)膜鋪片

9、分別檢測OIR成模情況和OIR小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)屏障功能。P18行腹腔注射伊文思藍(lán)測定視網(wǎng)膜組織中染料含量，定量檢測視網(wǎng)膜內(nèi)屏障功能。P8、P11、P13、P15、P18和P21提取視網(wǎng)膜組織RNA和蛋白，分別行實時熒光定量PCR和Western blot檢測Claudins的mRNA和蛋白表達(dá)的動態(tài)變化，P18行視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光染色激光共聚焦掃描顯微鏡檢測Claudin-1、-2和-5的空間分布特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：FITC-Dex

10、tran灌注視網(wǎng)膜鋪片顯示P18天時，OIR小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量新生血管生成伴視乳頭周圍無灌注區(qū)形成，伊文思藍(lán)腹腔注射視網(wǎng)膜鋪片顯示P18天OIR小鼠視網(wǎng)膜中大片染料滲漏，定量檢測OIR小鼠視網(wǎng)膜中染料含量為(20.47±6.73)μg×μl×h×μg-1，而正常小鼠視網(wǎng)膜中染料含量為(1.75±1.08)μg×μl×h×μg-1，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。實時熒光定量PCR檢測到Claudin-1～-4、-7、-12和-23在OIR和正常小

11、鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)存在差異；Western blot顯示在正常和OIR小鼠視網(wǎng)膜中，Claudin-2和-5的蛋白表達(dá)水平均呈先增高后降低的趨勢，Claudin-2和-5在P18達(dá)到高峰，與正常小鼠相比較，OIR小鼠視網(wǎng)膜中Claudin-1的表達(dá)在P8至P21各個時間點(diǎn)的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義，Claudin-2和-5在P15、P18和P21均表現(xiàn)升高，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。視網(wǎng)膜鋪片激光共聚焦顯微鏡掃描顯示正常P18小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)上這三

12、種緊密連接蛋白的分布具有一致性，它們均勻分布在各級血管上，呈線性紅色熒光圍繞血管內(nèi)皮細(xì)胞邊緣，呈梭形排列，在胞漿內(nèi)即網(wǎng)眼中偶爾可伴少量點(diǎn)狀染色，而在OIR小鼠視網(wǎng)膜中，血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接出現(xiàn)排列紊亂，但熒光強(qiáng)度反而升高，內(nèi)皮細(xì)胞邊界的線性熒光連續(xù)性中斷，新生血管團(tuán)中熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布特點(diǎn)更為明顯，網(wǎng)眼中的點(diǎn)、團(tuán)狀分布的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)。
　　 結(jié)論：Claudin-1、-2和-5在氧誘導(dǎo)的小鼠血管增殖性視網(wǎng)膜病變中新生血管內(nèi)皮