草魚(Ctenopharyngodon idellus)腸道緊密連接蛋白基因克隆與表達(dá)活性分析.pdf

1、飼料氧化油脂對(duì)養(yǎng)殖魚類健康和生長的毒副作用是一個(gè)急待研究的科學(xué)問題。飼料首先在腸道消化吸收，飼料氧化油脂及其主要成分首先會(huì)對(duì)腸黏膜產(chǎn)生損傷作用，如果腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能維持正常狀態(tài)，飼料氧化油脂的損傷作用就還只是腸道內(nèi)的損傷作用，然而，當(dāng)該屏障損傷時(shí)，細(xì)菌、類毒素等大分子物質(zhì)則會(huì)通過屏障進(jìn)入體循環(huán)，對(duì)遠(yuǎn)程實(shí)質(zhì)性器官如肝胰臟造成打擊。腸粘膜屏障的損傷主要表現(xiàn)為腸道通透性顯著增加，腸道通透性增加的主要途徑之一則是腸粘膜上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋

2、白合成受到影響，緊密連接出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性破壞。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)草魚中腸緊密連接結(jié)構(gòu)觀察、緊密連接蛋白基因的克隆和組織表達(dá)分析及中腸損傷后基因表達(dá)活性的分析，旨在證實(shí)草魚中腸是否存在緊密連接結(jié)構(gòu)并克隆獲得緊密連接蛋白基因的片段序列，同時(shí)初步探討?zhàn)B殖條件下可能存在的與草魚中腸損傷密切相關(guān)的緊密連接蛋白基因。
　　實(shí)驗(yàn)一草魚中腸緊密連接結(jié)構(gòu)觀察
　　通過透射電鏡（TEM），觀察草魚中腸的緊密連接結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：腸上皮細(xì)胞側(cè)面存在高電子

3、密度（黑色）連接線，高倍放大觀察，能看到連接線處有致密的黑點(diǎn)。將其與已有的緊密連接TEM圖對(duì)比，確定黑色連接線為腸道上皮細(xì)胞之間的連接，其頂部為緊密連接。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次觀察到草魚中腸的上皮連接結(jié)構(gòu)，其頂端應(yīng)為緊密連接結(jié)構(gòu)，證實(shí)了草魚中腸緊密連接結(jié)構(gòu)的物理性存在。
　　實(shí)驗(yàn)二草魚緊密連接蛋白基因克隆和組織表達(dá)分析
　　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室草魚腸道轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）結(jié)果，采用 prime5.0設(shè)計(jì)引物，通過 RT-PCR技術(shù)

4、克隆草魚Claudin-3、Claudin-12、Claudin-15a、Claudinb、Claudinc、Occludin、ZO-1、ZO-2isoform2、ZO-3基因片段序列，運(yùn)用DANMAN進(jìn)行片段序列的氨基酸推導(dǎo)和氨基酸同源性分析，確定所克隆基因?yàn)榫o密連接蛋白基因的組成，證實(shí)了草魚中腸緊密連接結(jié)構(gòu)的存在。同時(shí)，采用熒光定量 PCR（Q-RT-PCR）分析各緊密連接蛋白基因在草魚脾臟、肝胰臟及中腸的表達(dá)情況。結(jié)果表明：（1）

5、克隆獲得草魚 Claudin-3基因片段序列長1263bp，編碼131個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚 Claudin-3基因與其他物種的相似性在60%-88%之間；克隆獲得草魚Claudin-12基因片段序列長235bp，編碼23個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚 Claudin-12基因與其他物種的相似性在78%-100%之間；克隆獲得草魚Claudin-15a基因片段序列長490bp，編碼151個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚 Cl

6、audin-15a基因與其他物種的相似性在50%-92%之間；克隆獲得草魚Claudinb基因片段序列長776bp，編碼195個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚 Claudinb基因與斑馬魚和鯽魚的相似性分別為84%、89%；克隆獲得草魚Claudinc基因片段序列長662bp，編碼171個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚Claudinc基因與斑馬魚和鯽魚的相似性分別為95%、91%；克隆獲得草魚Occludin基因片段序列長1183bp，

7、編碼375個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚Occludin基因與其他物種的相似性在37%-88%之間；克隆獲得草魚 ZO-1基因片段序列長279bp，編碼93個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚ZO-1基因與其他物種的相似性在46%-88%之間；克隆獲得草魚ZO-2isoform2基因片段序列長762bp，編碼248個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚 ZO-2isoform2基因與其他物種的相似性在44%-89%之間；克隆獲得草魚ZO-3基因

8、片段序列長419bp，編碼139個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析表明草魚 ZO-3基因與其他物種的相似性在57%-82%之間。（2） Q-RT-PCR分析表明草魚脾臟、肝胰臟和中腸中各細(xì)胞質(zhì)蛋白基因和跨膜蛋白基因均有表達(dá)，且依次呈現(xiàn)出表達(dá)總量逐步增加，主要表達(dá)類型逐步多元化，即脾臟以ZO-1和Claudin-12表達(dá)為主，肝胰臟以ZO-2isoform2、ZO-3和Claudin-12、Claudin-3表達(dá)為主，中腸以ZO-1、ZO-2iso

9、form2、ZO-3和Claudinc、Claudin-15a、Claudin-12、Occludin表達(dá)為主。
　　實(shí)驗(yàn)三養(yǎng)殖條件下草魚中腸損傷后各緊密連接蛋白基因表達(dá)活性分析
　　本實(shí)驗(yàn)采用Q-RT-PCR檢測了養(yǎng)殖條件下草魚中腸損傷后各緊密連接蛋白基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示：草魚中腸損傷后，ZO-1表達(dá)上調(diào)，但差異不顯著；Claudinb、Claudin-15a、ZO-2isoform2、ZO-3表達(dá)下調(diào)，但