低蛋氨酸飲食對IBD大鼠緊密連接蛋白表達和功能的影響.pdf

1、炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)存在腸黏膜屏障功能受損，是IBD的潛在致病因素，并增加IBD復發(fā)的風險。所以，維持和恢復腸黏膜屏障功能將有利于提高腸道黏膜的防御功能，維持腸黏膜免疫穩(wěn)定，同時促進腸黏膜修復有助于維持緩解、減少疾病復發(fā)。近30年國內(nèi)外對低蛋氨酸(methioninerestriction，MetR)飲食的研究中發(fā)現(xiàn)MetR飲食調(diào)節(jié)生物體線粒體的功能，減少活性氧的產(chǎn)生，降低對大分子物質(zhì)的

2、氧化應激損傷，進而減少內(nèi)源性損傷以及增強大分子物質(zhì)抗氧化能力。低蛋氨酸處理的LLC-PK細胞和MetR飲食處理的SD大鼠細胞旁路通透性降低，細胞以及大鼠腸上皮屏障功能增加，上皮緊密連接蛋白的表達改變。最近一項單中心臨床試驗中發(fā)現(xiàn)MetR飲食有利于緩解CD患者的CDAI評分，由此我們推測：MetR飲食可能通過改變IBD腸上皮緊密連接的表達，降低腸黏膜通透性，從而修復腸黏膜屏障功能，促進炎癥緩解。
　　 目的：研究MetR飲食對IB

3、D大鼠腸黏膜病理變化、腸上皮通透性以及腸上皮緊密連接蛋白表達的影響，探討IBD患者應用MetR飲食促進和維持緩解的可能性。
　　 方法：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，全氨基酸飲食飼養(yǎng)(含蛋氨酸0.87％)，不限飲食，隨機分為DSS組(n=48)和對照組(n=42)，第7天按照DAI評分評估，以DAI>2.6，持續(xù)便血2天為條件篩選動物到下一步實驗。按照是否MetR飲食(含蛋氨酸0.17％)，將DSS組和對照

4、組分為：DSS+MetR，DSS+AA，MetR，AA組，每組15只。第21天腹主動脈血分析血常規(guī)和肝腎功能、電解質(zhì)，取腸組織，HE染色分析腸黏膜病理變化，檢測腸組織MPO活性，PCNA免疫組化染色分析腸上皮細胞的增殖狀況，采用Ussingchamber檢測腸上皮細胞跨膜電阻抗，短路電流，跨膜電勢差；通過RT-PCR、免疫組化和WesternBlot從轉錄水平和翻譯水平，以及蛋白的空間表達位置分析腸上皮緊密連接蛋白的表達。
　　

5、 結果：①經(jīng)DSS處理后大鼠全部出現(xiàn)腹瀉、便血、體重下降，HE染色第7天表現(xiàn)為腸上皮隱窩擴張、潰瘍，炎癥細胞的浸潤尚未及肌層；第14天表現(xiàn)為透壁炎癥細胞浸潤、腸上皮糜爛、廣泛潰瘍；第21鏡下觀察可見隱窩擴張、糜爛、糜爛上皮的周圍的可見多個淋巴濾泡增生。②MetR組大鼠同AA組比較，體重下降28％(n=15，P<0.01)，血BUN稍降低(n=9，P=0.041)。③MetR與從組腸上皮形態(tài)結構沒有差異，根據(jù)Gaudio評分標準，DSS+

6、MetR組腸黏膜炎癥損傷顯著低于DSS+AA組(n=9，P=-0.01)④DSS+MetR和DSS+AA血WBC計數(shù)沒有顯著性差異(n=9，P=1)、腸組織MPO活性也沒有顯著性差異(n=9，P=0.982)。⑤Ussingchamber測試結果顯示DSS處理大鼠跨膜電阻抗、電勢差顯著低于正常對照大鼠，MetR組較從組腸上皮跨膜電阻抗增加(n=6，P=0.007)，短路電流和電勢差沒有差異；DSS+MetR組腸上皮跨膜電阻抗與電勢差與D

7、SS+AA沒有顯著差異(n=6，P=0.93)，但檢測到DSS+MetR組大鼠短路電流值較DSS+AA組顯著降低(n=6，P=0.036)。⑤組化PCNA染色結果提示DSS處理后結腸上皮細胞增生，MetR與從組大鼠PCNA陽性率沒有差異，DSS+MetR組大鼠PCNA陽性率稍高于DSS+AA組，沒有顯著差異(n=9，P=0.434)⑥DSS處理大鼠腸上皮緊密連接蛋白mRNA表達顯著下降，同AA組比較，MetR組腸上皮occludin、c

8、laudin3、claudin5mRNA表達水平增加；與DSS+AA組比較，DSS+MetR組occludinmRNA表達量增加1.69倍(n=9，P=0.055)，claudin3mRNA表達水平增加2.05倍(n=9，P=0.026)，claudin2RNA的表達水平降低的1.84倍(n=9，P=0.03)，claudin1、claudin4、claudin5、claudin7、zo-1mRNA差異不明顯。⑥免疫組織化學提示DSS處

9、理組claudin2，claudin3，occludin，ZO-1熒光連不連續(xù)，斷裂，隱窩擴張，DSS+MetRclaudin3熒光強度顯著高于DSS+AA組，claudin2熒光強度較DSS+AA組弱，余未見明顯的差別。⑦Westernblot結果顯示MetR腸上皮claudin3蛋白表達量較AA大鼠增加2.02倍(n=9，P=0.02)，ZO-1、occlduin蛋白沒有差異。與DSS+AA組比較，DSS+MetR組claudin2

10、的表達量稍有降低(n=9，P=0.019)，claudin3蛋白的表達增加(n=9，P=0.003)，occludin蛋白表達DSS+從組大鼠稍增高，但是沒有顯著性差異(n=9，P=0.37)，
　　 結論：1.3％DSS經(jīng)飲水途徑誘導SD大鼠癥狀體征和病理表現(xiàn)和經(jīng)典IBD模型相同，本模型具有良好的可靠性和可重復性。2.IBD大鼠腸上皮緊密蛋白表達和空間結構改變，腸上皮通透性增加，腸黏膜屏障功能受損。3.MetR飲食顯著降低正常

11、大鼠腸道通透性，增加封閉性claudin蛋白和咬合蛋白的表達，表明MetR飲食可通過影響緊密連接的表達和結構而增強腸上皮屏障功能。4.與完全氨基酸飲食喂養(yǎng)組相比，MetR飲食減輕IBD大鼠腸黏膜炎癥損傷，然而血WBC、腸組織MPO酶水平和PCNA細胞無顯著差異，腸上皮通透性下降，緊密連接蛋白組成和空間結構改變，表明MetR飲食不通過調(diào)節(jié)炎癥細胞浸潤以及促進腸細胞生長的途徑緩解炎癥損傷，而可能通過改變緊密連接蛋白結構和功能而增加IBD大鼠