緊密連接蛋白Occludin在機械通氣誘發(fā)肺損傷中的作用及機制.pdf

1、目的：機械通氣誘發(fā)肺損傷(ventilationinducedlunginjury，VILI)是指應(yīng)用呼吸機時由于機械通氣諸多因素和肺部原發(fā)病交叉作用引起的肺損傷。其根本原因是肺泡膜的完整性破壞及通透性的改變，緊密連接(tightjunction，TJ)蛋白是維持黏膜上皮機械屏障和通透性的重要結(jié)構(gòu)，主要包括Zo-1、Claudin和閉鎖蛋白(Occludin)等。研究表明，在炎癥、低鈣、過氧化氫等刺激下，細胞內(nèi)PKC，Src等蛋白激酶以

2、及蛋白磷酸酶PP2A、PP1等被激活后，作用于Occludin其分子結(jié)構(gòu)中不同位點，使其磷酸化和去磷酸化，從而調(diào)節(jié)Occludin蛋白的表達，調(diào)控細胞間的TJ降解或者形成，所以本實驗通過建立不同潮氣量機械通氣大鼠模型，研究不同潮氣量對大鼠肺組織Occludin蛋白表達的影響，使用PKC抑制劑調(diào)節(jié)Occludin蛋白的表達來研究Occludin蛋白的表達量變化與VILI的關(guān)系。
　　方法：SPF級健康Wistar大鼠30只，雌雄各1

3、5只，體重250～300g，實驗前12h禁食，自由飲水。將大鼠隨機分為5組(n=6):對照組（C組）、小潮氣量組(S組)、小潮氣量+PKC抑制劑組（S+P組）、大潮氣量組（L組）、大潮氣量+PKC抑制劑組（L+P組）。用10％水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，頸部正中切開置入氣管導(dǎo)管，設(shè)定大潮氣量組VT為42ml/kg，小潮氣量組VT為7ml/kg，呼吸頻率RR為40次/min，吸呼比為I∶E1∶2，呼吸末正壓通氣PEEP為0

4、，吸入氧濃度FiO2為21％，機械通氣時間為4h。S+P組、L+P組于麻醉前1h肌肉注射PKC抑制劑BisindolylmaleimideⅠ0.12mg/kg。C組在氣管切開后，其它四組自機械通氣4h后自頸總動脈放血處死大鼠，留取血液標(biāo)本并進行肺灌注沖洗干凈后取肺組織。鉗夾左主支氣管，取右肺中上葉，置于凍存管速存液氮，用于Westernblot檢測Occludin的表達;取右下肺組織在多聚甲醛中固定48～72h，用于HE及免疫組化染色觀

5、察肺組織病理學(xué)改變及Occludin的分布;左肺組織用吸水紙吸去肺表面水分和血液后稱濕重，然后置于烤箱(70℃，72h)烤至恒重，稱干重，計算肺的濕/干重(W/D)比。
　　結(jié)果：肉眼可見L組肺組織表面近主支氣管處有散在出血，肺水腫肺出血明顯，其他各組病理改變不明顯。光鏡下觀察，S組肺泡壁輕度增厚，血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)無明顯滲血而L組肺組織失去正常的結(jié)構(gòu)，肺泡腔滲血嚴(yán)重，周圍有炎癥細胞浸潤，甚至有非透明膜的形成，病

6、理改變較重，而其他3組肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯異常。S+P組和L+P組肺組織病理學(xué)損傷較S組和L組減輕。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)Occludin蛋白主要表達在肺血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞。與C組比較，其余4組Occludin蛋白表達下調(diào)，肺組織W/D比升高(P＜0.05)，與S組比較，L組Occludin蛋白表達下調(diào)，肺組織W/D比升高，S+P組Occludin蛋白表達上調(diào)，肺W/D比降低(P＜0.01);與L組比較，L+P組Occludin蛋白表達上