緊密連接蛋白Occludin在機械通氣誘發(fā)肺損傷中的作用及機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:機械通氣誘發(fā)肺損傷(ventilationinducedlunginjury,VILI)是指應(yīng)用呼吸機時由于機械通氣諸多因素和肺部原發(fā)病交叉作用引起的肺損傷。其根本原因是肺泡膜的完整性破壞及通透性的改變,緊密連接(tightjunction,TJ)蛋白是維持黏膜上皮機械屏障和通透性的重要結(jié)構(gòu),主要包括Zo-1、Claudin和閉鎖蛋白(Occludin)等。研究表明,在炎癥、低鈣、過氧化氫等刺激下,細胞內(nèi)PKC,Src等蛋白激酶以

2、及蛋白磷酸酶PP2A、PP1等被激活后,作用于Occludin其分子結(jié)構(gòu)中不同位點,使其磷酸化和去磷酸化,從而調(diào)節(jié)Occludin蛋白的表達,調(diào)控細胞間的TJ降解或者形成,所以本實驗通過建立不同潮氣量機械通氣大鼠模型,研究不同潮氣量對大鼠肺組織Occludin蛋白表達的影響,使用PKC抑制劑調(diào)節(jié)Occludin蛋白的表達來研究Occludin蛋白的表達量變化與VILI的關(guān)系。
  方法:SPF級健康Wistar大鼠30只,雌雄各1

3、5只,體重250~300g,實驗前12h禁食,自由飲水。將大鼠隨機分為5組(n=6):對照組(C組)、小潮氣量組(S組)、小潮氣量+PKC抑制劑組(S+P組)、大潮氣量組(L組)、大潮氣量+PKC抑制劑組(L+P組)。用10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后,頸部正中切開置入氣管導(dǎo)管,設(shè)定大潮氣量組VT為42ml/kg,小潮氣量組VT為7ml/kg,呼吸頻率RR為40次/min,吸呼比為I∶E1∶2,呼吸末正壓通氣PEEP為0

4、,吸入氧濃度FiO2為21%,機械通氣時間為4h。S+P組、L+P組于麻醉前1h肌肉注射PKC抑制劑BisindolylmaleimideⅠ0.12mg/kg。C組在氣管切開后,其它四組自機械通氣4h后自頸總動脈放血處死大鼠,留取血液標(biāo)本并進行肺灌注沖洗干凈后取肺組織。鉗夾左主支氣管,取右肺中上葉,置于凍存管速存液氮,用于Westernblot檢測Occludin的表達;取右下肺組織在多聚甲醛中固定48~72h,用于HE及免疫組化染色觀

5、察肺組織病理學(xué)改變及Occludin的分布;左肺組織用吸水紙吸去肺表面水分和血液后稱濕重,然后置于烤箱(70℃,72h)烤至恒重,稱干重,計算肺的濕/干重(W/D)比。
  結(jié)果:肉眼可見L組肺組織表面近主支氣管處有散在出血,肺水腫肺出血明顯,其他各組病理改變不明顯。光鏡下觀察,S組肺泡壁輕度增厚,血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤,肺泡腔內(nèi)無明顯滲血而L組肺組織失去正常的結(jié)構(gòu),肺泡腔滲血嚴(yán)重,周圍有炎癥細胞浸潤,甚至有非透明膜的形成,病

6、理改變較重,而其他3組肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯異常。S+P組和L+P組肺組織病理學(xué)損傷較S組和L組減輕。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)Occludin蛋白主要表達在肺血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞。與C組比較,其余4組Occludin蛋白表達下調(diào),肺組織W/D比升高(P<0.05),與S組比較,L組Occludin蛋白表達下調(diào),肺組織W/D比升高,S+P組Occludin蛋白表達上調(diào),肺W/D比降低(P<0.01);與L組比較,L+P組Occludin蛋白表達上

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