海馬齒狀回的一氧化氮在學(xué)習(xí)記憶中的作用.pdf

1、學(xué)習(xí)和記憶是大腦最重要的功能，而突觸傳遞效應(yīng)的長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation,LTP）是學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)生理學(xué)基礎(chǔ)之一。海馬是機(jī)體完成學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，它主要分為CA1、CA3和齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)，其中DG區(qū)作為信息進(jìn)入海馬的傳入點(diǎn)，在新信息的處理和編碼以及學(xué)習(xí)記憶中起著至關(guān)重要的作用。在海馬各亞區(qū)不僅高頻電刺激可誘導(dǎo)出LTP，學(xué)習(xí)記憶行為也可以誘發(fā)出 LTP樣反應(yīng)，后者稱之為

2、習(xí)得性 LTP。目前較公認(rèn)的海馬 LTP的產(chǎn)生機(jī)制是激活突觸后膜的谷氨酸能NMDA受體，繼而觸發(fā)一系列與Ca2+有關(guān)的生理生化反應(yīng)，包括一氧化氮（nitric oxide,NO）的產(chǎn)生，而在此過程中NO作為逆行信使作用于突觸前膜，使后者的遞質(zhì)釋放維持高水平，最終形成LTP。NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中非常重要的氣體神經(jīng)信使，它在海馬LTP中的逆行信使作用多數(shù)是在海馬腦片的離體實(shí)驗(yàn)上得到證實(shí)的，而以神經(jīng)遞質(zhì)釋放做為一個(gè)指標(biāo)、在整體水平上探討NO在

3、海馬習(xí)得性LTP中的作用機(jī)制的報(bào)道少見。此外，雖然研究報(bào)道DG區(qū)存在高密度的神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal nitrec oxcied synthases,nNOS），但DG內(nèi)的NO在習(xí)得性LTP中的作用及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究的第一部分，在清醒、自由活動(dòng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶過程中，觀察DG區(qū)微量注射一氧化氮合酶（nitrec oxcied synthases，NOS）抑制劑或NO供體對DG區(qū)細(xì)胞外液中的谷氨酸含量及突觸傳遞效應(yīng)

4、的影響。
　　阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是老年癡呆癥的主要類型，其主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，而病理學(xué)表現(xiàn)以腦內(nèi)神經(jīng)元淀粉樣蛋白（amyloidβprotein,Aβ）沉積與纖維糾結(jié)為主。文獻(xiàn)報(bào)道AD的認(rèn)知功能障礙與Glu及其促離子型受體（包括NMDA、AMPA受體），以及NO的異常相關(guān)。本課題組先前的研究表明，海馬DG的NO可通過增加局部天冬氨酸（asparate,Asp）和谷氨酸（glutam

5、ate,Glu）的釋放來參與習(xí)得性LTP的產(chǎn)生過程，且NMDA和AMPA受體也在DG區(qū)習(xí)得性LTP的產(chǎn)生中起重要作用，但是，DG內(nèi)的NO以及Glu能系統(tǒng)在AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶及相關(guān)突觸可塑性中的作用尚不清楚。因此，本研究以前期工作和第一部分實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，在第二部分探討AD模型大鼠海馬DG內(nèi)的NO在學(xué)習(xí)記憶及相關(guān)突觸可塑性中的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)的具體內(nèi)容如下：
　　1.第一部分：
　?。?）利用腦部微量注射法往DG區(qū)給予NO

6、S抑制劑（NG-methyl-l-arginine acetate salt，L-NMMA）或NO供體（sodium nitroprusside，SNP），觀察其對DG區(qū)Glu含量與突觸傳遞效應(yīng)的影響；
　?。?）利用同時(shí)觀察清醒大鼠的學(xué)習(xí)行為、DG區(qū)突觸傳遞效應(yīng)（fild excitatory postsynaptic，fEPSP）和Glu含量的整體水平實(shí)驗(yàn)平臺，觀察DG區(qū)給予L-NMMA和SNP對上述三種指標(biāo)的影響；
　

7、　2.第二部分
　　（1）應(yīng)用雙側(cè)卵巢摘除法（ovariectomy，OVX）結(jié)合腹腔注射D-半乳糖（D-galactose，D-gal）制備AD模型，利用腦部微量透析法和高效液相色譜法測定海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的Asp、Glu和谷氨酰胺（glutamine，Gln，Glu合成的前體物質(zhì)）的含量，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法觀察DG區(qū)Aβ沉積情況以及NMDA和AMPA受體的表達(dá)；
　?。?）利用Morris水迷宮測定AD大鼠的學(xué)習(xí)記

8、憶行為，并在此過程中觀察海馬DG區(qū)的Asp、Glu和Gln含量的變化，以及DG區(qū)fEPSP幅度的變化；
　?。?）觀察DG區(qū)注射L-NMMA對AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為、DG區(qū)突觸傳遞效應(yīng)和習(xí)得性LTP的影響；
　　（4）觀察DG注射NMDA受體阻斷劑（dizocilpine,MK-801）或AMPA受體阻斷劑（6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione,CNQX）對AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為、DG區(qū)突

9、觸傳遞效應(yīng)和習(xí)得性LTP的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下：
　　1.第一部分：
　?。?）在非訓(xùn)練組，海馬DG區(qū)微量注射L-NMMA降低DG區(qū)Glu含量及fEPSP幅值，而給予SNP卻增加DG區(qū)Glu含量及fEPSP幅值（均為P<0.05），而且Glu含量的變化與fEPSP幅值變化是相平行的。
　?。?）每天穿梭箱訓(xùn)練前往DG區(qū)注射改良Ringer’s液的對照組，海馬DG區(qū)的Glu含量與fEPSP幅值在條件反射的建

10、立期間明顯增加（均為P<0.05），而在條件反射消退期間逐漸回到訓(xùn)練前水平；在此過程中，Glu含量與fEPSP幅值的變化相平行，且這些變化與行為正確反應(yīng)率的變化是基本一致的；
　?。?）每天訓(xùn)練前往 DG區(qū)微量注射 L-NMMA時(shí)，大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)明顯的損害，且DG區(qū)Glu含量及fEPSP幅值在訓(xùn)練過程中出現(xiàn)基本一致的降低并恢復(fù)的過程。
　　（4）每天訓(xùn)練前往DG區(qū)微量注射SNP時(shí)，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高（P<0.

11、05），而在訓(xùn)練過程中的DG區(qū)Glu含量與fEPSP幅值的變化與對照組相似，即在條件反射的建立期間明顯增加（均為P<0.05），且在消退期間逐漸恢復(fù)。
　　2.第二部分
　?。?）AD模型大鼠海馬DG區(qū)出現(xiàn)Aβ的沉積、細(xì)胞外液中的Glu和Asp含量明顯增加而Gln含量明顯減少、NMDA和AMPA受體的表達(dá)減少。
　?。?在MWM訓(xùn)練中，AD大鼠找到站臺的逃避潛伏期明顯延長，穿越原平臺區(qū)的次數(shù)明顯減少（均為P<0.05）

12、，提示出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)記憶障礙。
　?。?）對照組在MWM訓(xùn)練過程中出現(xiàn)海馬DG區(qū)fEPSP幅值的明顯增加（均為P<0.05），提示習(xí)得性LTP的形成，而在AD大鼠的海馬DG區(qū)，習(xí)得性LTP被明顯抑制。
　?。?）在MWM訓(xùn)練過程中，對照組DG區(qū)Glu和Gln含量在訓(xùn)練第2、3天明顯增加（均為P<0.05）其后回到訓(xùn)練前水平；在AD組，Glu含量在5天的訓(xùn)練過程中均明顯增加，而Gln含量持續(xù)下降（均為P<0.05）。
　

13、　（5）在MWM訓(xùn)練過程中，對照組DG區(qū)Asp含量無明顯變化，在AD組，Asp含量逐漸下降，在訓(xùn)練第2-5天明顯低于訓(xùn)練前（均為P<0.05）。
　　（6）往海馬DG區(qū)注射L-NMMA和MK-801，而非CNQX，可增加AD大鼠DG區(qū)突觸傳遞效應(yīng)。
　?。?）往海馬DG區(qū)注射L-NMMA和MK-801，可改善AD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，且使DG區(qū)的習(xí)得性LTP恢復(fù)到正常水平；而CNQX改善空間學(xué)習(xí)能而非空間記憶能力，且使DG

14、區(qū)習(xí)得性LTP形成延后。
　　通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到以下結(jié)論：
　　1.海馬DG內(nèi)的NO可通過增加DG局部Glu水平和突觸傳遞效應(yīng)來促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶，并作為逆行信使參與習(xí)得性LTP的形成過程。
　　2. AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶損害與DG局部的Aβ沉積、Glu和Asp的濃度增加、以及NMDA和AMPA受體的過度激活有關(guān)。
　　3. AD大鼠海馬DG區(qū)的NMDA和AMPA受體表達(dá)下調(diào)可能是針對Glu能系統(tǒng)過度激活的一種代償機(jī)