新型TLR配體Zymosan--A的輻射防護作用及其初步機制研究.pdf

1、研究背景:
　　近年來，核能與輻射技術已經(jīng)廣泛應用于民用、醫(yī)療及軍事領域，核能在給人類帶來巨大福利的同時，也為人類的健康帶來了巨大的威脅與挑戰(zhàn)。電離輻射導致的放射性損傷已經(jīng)成為國民經(jīng)濟、社會發(fā)展和國防建設中迫切需要解決的關鍵科技問題之一。深入研究和探索輻射損傷防護新靶點，研制新型高效的輻射損傷防護劑具有重要的意義。
　　2008年Science主刊首次報道TLR5激動劑CBLB502在動物體內具有明顯的輻射防護作用，使得TL

2、R及其TLR相關配體在電離輻射防護研究領域得到了越來越多的關注，此后科學家們相繼發(fā)現(xiàn)靶向激活TLR2/TLR4/TLR9均具有明顯的輻射防護效果。前期通過對TLR及其相關配體進行大量預實驗篩選，并最終篩選得到一種新型TLR配體Zymosan-A，Zymosan-A又稱酵母多糖，是一類通過β-1，3糖苷鍵連接的葡聚糖，預實驗結果表明其具有明顯的輻射防護效果。
　　在本課題中，開展了Zymosan-A的輻射防護作用及其初步機制的研究。

3、本研究課題中主要分為三個部分，分別是Zymosan-A的急性毒性實驗研究，Zymosan-A的輻射防護效應研究和Zymosan-A的輻射防護效應初步機制探索。
　　研究目的:
　　1.系統(tǒng)性研究Zymosan-A對在體動物，輻射敏感組織和體外細胞的輻射防護效應。
　　2.對Zymosan-A的輻射防護作用機制進行初步探索，試圖篩選潛在輻射防護新靶點。
　　研究方法:
　　1.Zymosan-A溶解。

4、　　Zymosan-A購買自Sigma公司，采用生理鹽水溶解配制不同濃度梯度溶液。
　　2.Zymosan-A的急性毒性實驗。
　　(1)采用小鼠體內急性動物實驗，經(jīng)腹腔注射給予小鼠不同劑量梯度Zymosan-A，連續(xù)觀察其10天生存期，評價Zymosan-A對整體動物的急性毒性。
　　(2)采用CCK-8細胞活力檢測方法，給予不同細胞不同濃度梯度Zymosan-A刺激24小時后，采用酶標儀檢測細胞活力的變化。

5、　　3.Zymosan-A的輻射防護效應研究。
　　(1)小鼠急性放射損傷模型的建立。采用本教研室設計的C57BL/6小鼠固定模型固定小鼠，使用海軍軍醫(yī)大學輻照中心60Co Gamma射線源對小鼠進行大劑量單次Gamma射線照射，制備小鼠急性放射性損傷模型。
　　(2)Zymosan-A對整體動物的防護效應。對小鼠進行不同劑量單次Gamma射線照射后計算照后小鼠生存率及平均存活時間，繪制生存曲線評價Zymosan-A對整體動

6、物的防護效應。
　　(3)Zymosan-A對體外細胞的防護效應。照后24小時采用CCK-8實驗和流式細胞術檢測受照細胞的細胞活力和細胞凋亡率，評價Zymosan-A對體外細胞的防護效應。
　　(4)Zymosan-A對受照小鼠輻射敏感組織的防護效應。采用動物血細胞分類計數(shù)儀檢測受照小鼠外周血白細胞數(shù)目變化;采用流式細胞術檢測受照小鼠骨髓有核細胞數(shù)目變化和凋亡情況;采用稱量方式計算受照小鼠脾臟臟器指數(shù);采用病理HE染色方法檢

7、測受照小鼠骨髓微結構、血竇出血等情況。
　　4.新型TLR配體Zymosan-A輻射防護初步機制探討。
　　(1)采用TLR2/4基因敲除小鼠初步驗證Zymosan-A的防護機制。對TLR2，TLR4基因敲除小鼠進行大劑量單次Gamma射線照射，計算照后基因敲除小鼠生存率及平均存活時間，繪制生存曲線。
　　(2)Zymosan-A對受照小鼠體內輻射防護細胞因子的調控作用。對小鼠進行大劑量單次Gamma射線照射后，通過酶

8、聯(lián)免疫吸附實驗檢查照后小鼠體內輻射防護細胞因子的表達水平。
　　(3)Zymosan-A對受照小鼠骨髓原代細胞的凋亡抑制作用。對小鼠進行大劑量單次Gamma射線照射24小時后，采用流式細胞術檢測小鼠骨髓原代細胞的凋亡水平的變化。
　　(4)Zymosan-A對受照小鼠骨髓原代細胞胞內細胞因子的表達水平作用。對小鼠進行大劑量單次Gamma射線照射24小時后，通過流式細胞胞內細胞因子染色技術檢測骨髓原代細胞胞內GM-CSF，G-

9、CSF，IL-12和IL-6的表達水平變化。
　　(5)Zymosan-A對受照小鼠造血干細胞的輻射防護作用。對小鼠進行大劑量單次Gamma射線照射，照后24小時用流式細胞術檢測造血干細胞的比例變化。
　　(6)Zymosan-A對DNA損傷反應的影響。對AHH-1進行Zymosan-A藥物刺激后進行單次Gamma射線照射后，檢測γ-H2AX foci的形成以評價Zymosan-A對照射引起DNA損傷雙鏈斷裂的影響。

10、　　(7)RNA-SEQ方法鑒定Zymosan-A輻射防護的新效應分子及信號通路。照射前24小時和2小時采用腹腔注射的方式給予C57BL/6小鼠Zymosan-A，隨后對小鼠進行大劑量單次Gamma射線照射，照后24小時取小鼠骨髓原代細胞，裂解紅細胞后提取RNA進行RNA-SEQ。隨后計算基因表達量并分析樣品間差異表達基因，并對差異基因進行熱圖分析，GO分析和KEGG生物通路富集分析。
　　研究結果:
　　1.新型TLR配體

11、Zymosan-A的急性毒性實驗
　　(1)小鼠體內急性毒性實驗。通過小鼠體內急性毒性實驗計算得出Zymosan-A藥物半致死劑量約為666.7mg/kg，而試驗中每只小鼠最佳給藥劑量為25/kg mg+25mg/kg，遠低于其藥物半致死劑量。
　　(2)體外細胞急性毒性實驗。試驗中細胞最佳給藥劑量為40μg/ml，遠低于藥物致死劑量。
　　2.新型TLR配體Zymosan-A的輻射防護效應研究。
　　(1)小鼠

12、急性放射損傷模型的建立。采用本教研室設計的C57BL/6小鼠固定模型固定小鼠，使用海軍軍醫(yī)大學輻照中心60Co源對小鼠進行單次大劑量Gamma射線照射，制備小鼠急性放射性損傷模型。
　　(2)Zymosan-A對整體動物的輻射防護損傷效應。生存期實驗結果發(fā)現(xiàn)在多個劑量照射條件下，照射給藥組較單純照射組小鼠生存率明顯提高;平均存活時間明顯延長。
　　(3)Zymosan-A對體外細胞的輻射損傷防護效應。CCK-8和流式細胞術實

13、驗結果表明給藥組較單純照射組細胞活力明顯提高，照后24小時凋亡率明顯下降。
　　(4)Zymosan-A對受照小鼠輻射敏感組織的防護效應。實驗結果表明給藥照射組較單純照射組外周血白細胞數(shù)目明顯增加;骨髓有核細胞數(shù)目明顯增加，凋亡率明顯下降;照射給藥組較單純照射組其脾指數(shù)明顯增加;骨髓病理HE染色結果表明照射給藥組較單純照射組，其血竇結果破壞輕微，出血量少，藍染有核細胞明顯增加，且骨髓損傷修復速度明顯高于單純照射組。
　　5.

14、新型TLR配體Zymosan-A輻射防護初步機制探討。
　　(1)采用TLR2/4基因敲除小鼠初步驗證Zymosan-A的輻射損傷防護機制?；蚯贸∈笊嫫诮Y果表明TLR2和TLR4基因敲除小鼠的輻射敏感性較野生型小鼠輻射敏感性增加，Zymosan-A對TLR4基因敲除小鼠發(fā)揮了明顯的輻射防護效果，而TLR2基因敲除后逆轉了Zymosan-A的輻射防護作用。
　　(2)Zymosan-A對受照小鼠體內輻射防護細胞因子的調控

15、作用。照前給予C57BL/6小鼠Zymosan-A刺激后，照后檢測小鼠體內輻射防護細胞因子表達水平變化，結果表明給藥組較單純照射組，小鼠體內IL-6，IL-11，IL-12，TNF-α的水平明顯上調。
　　(3)Zymosan-A對受照小鼠造血干細胞的輻射防護作用。照前給予C57BL/6小鼠Zymosan-A刺激后，照后通過流式細胞術檢測小鼠造血干細胞變化發(fā)現(xiàn)證實Zymosan-A可以促進造血干細胞向造血祖細胞分化。
　　(

16、4)Zymosan-A對DNA損傷反應的影響。γ-H2AX foci結果表明Zymosan-A明顯減少電離輻射后γ-H2AX foci的形成。
　　(5)RNA-SEQ方法鑒定Zymosan-A輻射防護的新效應分子及信號通路。通過高通量二代測序共篩選出131個顯著差異基因，其中30個顯著上調基因，101個顯著下調基因，之后對顯著差異基因進行熱圖分析，GO分析和KEGG分析，分析結果證實Zymosan-A的輻射防護作用主要通過調節(jié)照

17、后小鼠體內的免疫反應進程發(fā)揮電離輻射防護作用。
　　研究結論:
　　1.Zymosan-A對在體小鼠和體外細胞的最佳電離輻射防護劑量遠低于其毒性劑量，成為潛在輻射防護劑的可能性高。
　　2.Zymosan-A對在體小鼠，輻射敏感組織和體外細胞三個層面均發(fā)揮了明顯的輻射防護作用。
　　3.通過基因敲除小鼠證實Zymosan-A主要通過靶向激活TLR2信號通路，上調輻射防護因子IL-6，IL-11，IL-12，TNF