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文檔簡介
1、目的:研究EGCG對人皮膚HaCaT細(xì)胞放射敏感性的影響,進(jìn)一步探討表沒食子兒茶素沒食子酸脂(EGCG)對人正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞 HaCaT的輻射保護(hù)作用及其機(jī)制。
方法:選取人永生化正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCaT作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。(1)利用四氮唑鹽比色試驗(yàn)(MTT)測定EGCG或聯(lián)合X射線對HaCaT細(xì)胞活力的影響,篩選出合適的EGCG的濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn);(2)給予不同劑量X射線照射,應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測EGCG對HaCaT細(xì)胞存活
2、分?jǐn)?shù)及放射敏感性的影響;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測EGCG聯(lián)合X射線作用后,HaCaT細(xì)胞凋亡及周期分布的改變情況;(4)熒光顯微鏡觀察EGCG聯(lián)合X射線后HaCaT細(xì)胞線粒體及ROS的變化;(5)應(yīng)用Western-blot法分析EGCG聯(lián)合X射線作用后,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白 HO-1、SOD等的表達(dá)水平的變化;(6)免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測Nrf2表達(dá)變化;(7)MTT法檢測HO-1 siRNA或SnPP聯(lián)合EGC
3、G后輻射防護(hù)作用;(8)熒光素酶活性檢測 HO-1的誘導(dǎo)表達(dá);(9)免疫組化法觀察 EGCG對皮膚的誘導(dǎo)表達(dá)。
結(jié)果:(1)MTT檢測結(jié)果顯示:EGCG在0-75μmol/L濃度范圍內(nèi)聯(lián)合X射線可減輕輻射導(dǎo)致的 HaCaT細(xì)胞活力下降,而沒有明顯毒性作用;(2)細(xì)胞輻射敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:EGCG聯(lián)合輻射組細(xì)胞相比單純照射組,細(xì)胞克隆形成率均明顯提高(P<0.01)。對于HaCaT細(xì)胞,單純照射組和藥物+照射組平均致死劑量(D
4、0)值分別為2.43Gy、2.63Gy,準(zhǔn)閾劑量(Dq)值分別為1.78Gy、2.53Gy;(3)AnnexinⅤ/PI雙染法凋亡檢測結(jié)果顯示:對于HaCaT細(xì)胞,單純10、20Gy照射組細(xì)胞凋亡率分別是9.25%和12.41%,10Gy組經(jīng)50μM EGCG處理后,細(xì)胞凋亡率分別降低至7.82%和10.24%,20Gy組經(jīng)50μM EGCG處理后,細(xì)胞凋亡率分別降低至6.34%和8.00%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);流式細(xì)胞儀
5、分析細(xì)胞周期顯示:在照射劑量點(diǎn),對于HaCaT細(xì)胞,EGCG+照射組與單純照射組相比,G0/G1期細(xì)胞比例上升(p<0.01),G2/M期細(xì)胞比例下降,G2期阻滯緩解,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01);(5)Western-blot分析顯示:對HaCaT細(xì)胞,與單純照射組相比,EGCG+照射組的Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào),Bax蛋白表達(dá)水平增加,而細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白HO-1的表達(dá)量上升,而SOD沒有明顯改變;(6)免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果
6、顯示:EGCG+照射組HaCaT細(xì)胞使Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子向核內(nèi)轉(zhuǎn)移;(6) MTT法顯示HO-1 siRNA或SnPP聯(lián)合EGCG后輻射防護(hù)作用減輕;(7)熒光素酶活性檢測EGCG可以誘導(dǎo)HO-1的表達(dá);(8)免疫組化法觀察EGCG可誘導(dǎo)大鼠皮膚組織的HO-1的表達(dá)。
結(jié)論:EGCG對人皮膚HaCaT細(xì)胞具有輻射保護(hù)作用,EGCG可能通過清除X射線引起的HaCaT細(xì)胞內(nèi)的自由基,緩解G2期阻滯,改變凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、B
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