布魯斯菌VirB8基因疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究.pdf

1、布魯斯菌病(Brucellosis)是一種嚴(yán)重的人畜共患細(xì)菌病，流行廣泛，在很多發(fā)達(dá)國家仍不能根除。我國北方各省份如內(nèi)蒙古、山西、吉林、黑龍江、河北、寧夏等都有流行，尤以內(nèi)蒙、寧夏等牛羊存欄量大的省份流行嚴(yán)重。
　　 布魯斯菌可以在細(xì)胞內(nèi)寄居生長，引起的人類波狀熱以及反芻動物流產(chǎn)和睪丸炎等疾病?，F(xiàn)階段布魯斯菌控制中使用的疫苗都是布魯斯菌弱毒苗，我國主要使用的是豬種布魯斯菌S2(B.suis2 strain，S2)疫苗和牛種布魯斯

2、菌S19(B.abortus19 strain，S19)疫苗。雖然這些疫苗起到了一定的防治作用，但有的毒力較強，有的免疫保護率低，因此尚不能達(dá)到高效控制人畜布魯斯菌病的要求。
　　 核酸疫苗具有免疫持久、全面、制備簡單、性質(zhì)穩(wěn)定、不易復(fù)壯等多種優(yōu)點，并且可引起機體強烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，在對抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌感染方面極具潛力，因而在布魯斯菌的疫苗研究中得到了很大的發(fā)展。候選基因不僅有細(xì)菌外膜的抗原表位，而且更多的是胞質(zhì)中重要的毒力因子或

3、代謝成分，這提示我們可以選取其它重要的布魯斯菌胞內(nèi)蛋白作為核酸疫苗的候選基因，同時也啟發(fā)我們在進(jìn)行其它病原的核酸疫苗研究中也可以選取胞內(nèi)成分進(jìn)行研究。
　　 細(xì)菌分泌系統(tǒng)是(T4SS)近年來細(xì)菌致病機制研究的一個的重要發(fā)現(xiàn)，也是當(dāng)前的一個研究熱點。布魯斯菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)為VirB，是布魯斯菌的毒力基因，與其在宿主細(xì)胞內(nèi)生存、復(fù)制有關(guān)。布魯斯菌侵入機體被吞噬細(xì)胞吞噬形成吞噬小體后，VirB能有效地防止溶酶小體與吞噬小體融合避免被消化

4、，使布魯斯菌能在吞噬細(xì)胞中寄生，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上建立復(fù)制泡。另外，T4SS還可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。除此以外，T4SS還可以調(diào)控外膜蛋白的表達(dá)及其性質(zhì)，以適應(yīng)布魯斯菌寄生的內(nèi)外不良環(huán)境。
　　 VirB8是布魯斯菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的核心成分，可和多種蛋白相互作用調(diào)節(jié)分泌系統(tǒng)的裝配。VirB8在酸性培養(yǎng)條件下進(jìn)行表達(dá)，并隨著培養(yǎng)時間的延長而表達(dá)量提高，因此可以推測其在細(xì)菌被吞噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入酸性吞噬空泡后，在調(diào)節(jié)布魯斯菌的抗吞噬作用和細(xì)胞內(nèi)

5、的運輸中起重要作用。
　　 本研究以布魯斯菌VirB分泌系統(tǒng)中的VirB8基因作為核酸疫苗的候選靶基因，以pcDNA3.0真核表達(dá)載體為工具構(gòu)建布魯斯菌核酸疫苗pcDNA3.0-VirB8，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染試驗和實驗動物免疫試驗來檢測VirB8基因核酸疫苗的免疫效果，探討評價了其作為核酸疫苗的可行性。這些研究將為進(jìn)一步探討布魯斯菌VirB基因的核酸疫苗研究提供依據(jù)，以利于布魯斯菌病的治療和預(yù)防。
　　 一、方法
　　

6、 1、VirB8基因的PCR擴增
　　 根據(jù)NCBI網(wǎng)站中GeneBank中的VirB8核酸序列，設(shè)計了兩對特異性的引物。其中一對在另一對的基礎(chǔ)上添加了Kozak序列、酶切位點和保護性堿基以便于進(jìn)行酶切、克隆以及真核表達(dá)。以煮沸離心處理的S2布魯斯菌上清液作為模板，用不帶酶切位點的引物P1、P2進(jìn)行VirB8基因的PCR擴增。
　　 然后以第一輪的擴增產(chǎn)物為模板，利用添加了酶切位點的P3、P4引物進(jìn)行第二輪的擴增后，電泳

7、鑒定并膠回收。
　　 2、原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VirB8的構(gòu)建
　　 將pET-28a質(zhì)粒和膠回收的PCR擴增片段用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后電泳回收。連接后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒pET28a-VirB8酶切和PCR鑒定后進(jìn)行測序。
　　 3、重組VirB8的表達(dá)及其抗體的制備
　　 重組表達(dá)陽性菌誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE判定重組蛋白表達(dá)情況，

8、并對表達(dá)蛋白使用His單克隆抗體進(jìn)行Western blotting分析。
　　 重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，包涵體洗滌溶解后使用鎳柱親和純化，純化蛋白免疫小鼠后采取血清并使用Western blotting對血清中的抗體進(jìn)行分析。
　　 4、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-VirB8的構(gòu)建
　　 將pcDNA3.0質(zhì)粒和膠回收的PCR擴增片段用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后電泳回收。連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)

9、細(xì)胞，轉(zhuǎn)化克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒pcDNA3.0-VirB8酶切和PCR鑒定后進(jìn)行測序。
　　 5、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-VirB8的轉(zhuǎn)染及表達(dá)鑒定
　　 培養(yǎng)Vero細(xì)胞，使用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-VirB8質(zhì)粒。
　　 轉(zhuǎn)染24h后，用胰酶消化，細(xì)胞分裝三份，一份提取總RNA后使用RT-PCR判定pcDNA3.0-VirB8質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄情況;一份制備成蛋白樣品使用Western blotting判定

10、VirB8的表達(dá)情況;另一份涂片進(jìn)行間接免疫熒光檢測真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-VirB8在體內(nèi)表達(dá)的位置。
　　 6、pcDNA3.0-VirB8核酸疫苗免疫BALB/c小鼠
　　 將55只雌性BALB/c小鼠隨機分為三組:pcDNA3.0-VirB8免疫組25只、pcDNA3.0免疫組25只和空白對照組5只。pcDNA3.0-VirB8免疫組和pcDNA3.0免疫組分別于0、14、28天在脛前肌分別注射100μg

11、pcDNA3.0-VirB8質(zhì)粒和pcDNA3.0質(zhì)粒，并分別于0、14、28、42天采血或脾臟進(jìn)行抗體、細(xì)胞因子及淋巴細(xì)胞增殖試驗的檢測。
　　 7、免疫小鼠血清特異性抗體及細(xì)胞因子的檢測
　　 分別采用間接ELISA方法檢測小鼠血清中特異性IgG、IgG1、IgG2a、IFN-γ和IL-4的含量，以確定pcDNA3.0-VirB8核酸疫苗的體液和細(xì)胞免疫效果。
　　 8、淋巴細(xì)胞增殖試驗
　　 無菌取

12、出小鼠脾臟，吹打法制備細(xì)胞懸液。用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/mL，于96孔板中每孔加入200μL，再加入2μL rVirB8(1μg/μL)，于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)60h。然后每孔加入MTT至終濃度為5μg/μL，繼續(xù)培養(yǎng)6h加入200μL的DMSO震蕩10分鐘后檢測吸光度值(A560nm)，計算刺激指數(shù)。
　　 9、攻毒保護試驗
　　 將第3次免疫后兩周的各組小鼠后肢脛前肌注

13、射100μL濃度為2×106活菌/μL的布魯斯菌S2株進(jìn)行攻毒。攻毒后第21d無菌取脾臟研磨成組織懸液，倍比稀釋后接種到布魯斯菌選擇性培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計數(shù)，計算攻毒保護率。
　　 二、實驗結(jié)果
　　 1、以煮沸的S2菌株作為模板，采用PCR方法擴增出了730bp左右的基因片段，與VirB8大小一致。構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VirB8后的測序結(jié)果表明，擴增出的基因為VirB8。
　　 2、構(gòu)

14、建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VirB8誘導(dǎo)后SDS-PAGE及Western blotting分析出現(xiàn)約30kDa大小的蛋白表達(dá)，與VirB8融合蛋白的大小一致。純化的重組VirB8蛋白免疫小鼠后得到的血清可和純化的VirB8蛋白以及布魯斯菌S2裂解蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　 3、構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-VirB8轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，RT-PCR表明其可在Vero細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，We

15、stern blotting表明其表達(dá)蛋白可和重組VirB8免疫血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-VirB8可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。間接免疫熒光顯示表達(dá)部位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 4、布魯斯菌核酸疫苗pcDNA3.0-VirB8免疫小鼠后可以刺激其產(chǎn)生特異性IgG抗體，抗體亞型ELISA表明其產(chǎn)生的抗體主要是IgG2a。同時，免疫小鼠還表現(xiàn)出了明顯的IFN-γ的分泌升高，但細(xì)胞因子IL-4的升高不顯著。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

16、試驗也表明基因疫苗免疫鼠的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著上升。這些都表明核酸疫苗pcDNA3.0-VirB8主要激發(fā)以Th-1型為主的免疫應(yīng)答。
　　 5、免疫小鼠的攻毒保護試驗顯示，核酸疫苗pcDNA3.0-VirB8可以顯著減少小鼠脾內(nèi)布魯氏菌S2的定植數(shù)量，顯示了一定的免疫保護。
　　 三、結(jié)論
　　 1、VirB8蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　 2、用VirB8作為編碼基因構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcD