重組RSV疫苗構(gòu)建及免疫效果初步評價(jià).pdf

1、呼吸道合胞病毒（RSV）是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原體。據(jù)報(bào)道，全球每年5歲以下兒童感染RSV人數(shù)達(dá)3,300萬，死亡人數(shù)約為16萬人。RSV的復(fù)感率高，2歲以下兒童超過90％至少感染過一次RSV，其中70％患者發(fā)生住院感染且并發(fā)細(xì)支氣管炎、肺炎及哮喘，老年人常導(dǎo)致阻塞性肺病且伴有心肺并發(fā)癥。RSV每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重威脅人類健康，而研制RSV疫苗的工作自上世紀(jì)60年代開展至今，仍沒有認(rèn)證的有效

2、疫苗上市。因此，WHO將RSV疫苗的研制列為急迫解決的問題之一。
　　1960年，應(yīng)用福爾馬林滅活病毒后制備的FI-RSV疫苗應(yīng)用于臨床，其不但沒有起到防控作用，反而引起免疫增強(qiáng)性疾?。‥RD）從而導(dǎo)致2名患嬰死亡。隨后出現(xiàn)利用傳統(tǒng)方法研制的多種RSV疫苗，雖然取得一定的成效，但大多止步于臨床試驗(yàn)。亞單位疫苗被認(rèn)為是最有可能發(fā)展為預(yù)防老年人感染RSV的疫苗，而減毒活疫苗是最有可能成為預(yù)防嬰幼兒感染RSV的候選疫苗株。許多國際前沿研

3、究對這兩種疫苗形式也有很多探索。Qing Yan等人從臨床標(biāo)本分離采用連續(xù)傳代方法篩選制備冷適應(yīng) KM516-AS疫苗，但存在毒力返祖現(xiàn)象而未批準(zhǔn)臨床試驗(yàn)。Jin和 Ruth等人采用反向遺傳學(xué)、基因重組技術(shù)分別研制出 rA2DM2-2及rA2cp248/404/1030ΔSH疫苗，Ⅰ期臨床研究結(jié)果表現(xiàn)出良好的免疫原性及保護(hù)性，但因減毒不夠或減毒過度等問題存在安全隱患。MedImmune、Novatis等研制的F蛋白亞單位疫苗（PFP）臨

4、床研究，Ⅰ期實(shí)驗(yàn)證實(shí)PFP用于健康成人、12個(gè)月以上的兒童和孕婦是安全的，具有免疫原性，但疫苗并沒有完全解決偏向 Th2免疫應(yīng)答的問題，仍存在易引起免疫過激等安全性問題。因此，著力研制亞單位疫苗和減毒活疫苗，對RSV疾病的防治具有深遠(yuǎn)意義。
　　選擇優(yōu)勢的保護(hù)性抗原對RSV疫苗的制備至關(guān)重要。F蛋白是RSV病毒主要保護(hù)性抗原，具有高度的保守性，F(xiàn)蛋白被單克隆抗體作為識別靶點(diǎn)，現(xiàn)今大多數(shù)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的RSV候選疫苗多選擇F蛋白作為抗

5、原靶標(biāo)，在疫苗研究中應(yīng)用廣泛。
　　近年來,將納米技術(shù)應(yīng)用于疫苗研究是近年來的熱點(diǎn)，也被估計(jì)具有一千多億的市場價(jià)值。無論是通過納米顆粒自身激活或強(qiáng)化免疫，還是作為投遞系統(tǒng)或免疫刺激佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答，都得到了廣泛的探索和應(yīng)用。預(yù)示著納米顆粒有望使疾病的治療和生物活性組分的遞送發(fā)生革命性的變革。
　　針對免疫途徑的選擇，鼻腔免疫所需的疫苗量和佐劑量較小，能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答后誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答。同時(shí)，減毒活疫苗通過鼻腔免疫

6、能模擬病毒的自然感染，引起局部黏膜和系統(tǒng)免疫，使機(jī)體獲得更顯著的免疫原性和更廣泛的保護(hù)性。
　　因此，基于以上現(xiàn)狀，本研究立足于創(chuàng)新型RSV疫苗的制備。本研究分兩個(gè)部分：一是通過構(gòu)建重組RSV F蛋白自組裝納米顆粒疫苗，探索RSV F蛋白的抗原形式、免疫應(yīng)答方式及免疫保護(hù)效果；二是采用冷適應(yīng)流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)，構(gòu)建嵌合 RSV中和抗原表位的重組 FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗，探索嵌合 RSV中和抗原表位的重組 FLU/

7、RSV/NA-3F減毒活疫苗的免疫原性及免疫保護(hù)效果。
　　一、重組RSV F納米顆粒疫苗株構(gòu)建及免疫效果研究
　　本研究以RSV關(guān)鍵保護(hù)性抗原F蛋白分子為靶標(biāo)，通過昆蟲表達(dá)系統(tǒng)制備由多個(gè)F蛋白寡聚體自組裝的納米顆粒，并通過滴鼻免疫BABL/c小鼠，檢驗(yàn)評價(jià)其免疫原性及免疫保護(hù)效果，為發(fā)展RSV新型疫苗提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：制備重組RSV F納米顆粒（RSV F NPs）疫苗，并對重組疫苗的免疫原性及免疫保護(hù)效果進(jìn)

8、行鑒定，對納米顆粒型疫苗的實(shí)踐性和可行性進(jìn)行初步探討。
　　方法：應(yīng)用生物信息學(xué)方法將野生型RSV F蛋白氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變設(shè)計(jì)，使F蛋白糖基化修飾，同時(shí)對改造后氨基酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建pFastBacⅠ-F質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)座得到重組桿粒Bacmid-F，桿粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)的桿狀病毒株。擴(kuò)大培養(yǎng)后經(jīng)超濾濃縮、親和層析方法純化F蛋白，采用Western blot、電鏡等方法鑒定觀察納米顆粒組裝情況。RS

9、V F納米顆粒疫苗滴鼻免疫BABL/c小鼠，ELISA法檢測小鼠血清中特異性抗體及鼻肺灌洗液中sIgA抗體效價(jià)，微量中和檢測針對RSV病毒的中和抗體，ELISPOT法檢測脾淋巴細(xì)胞分泌特異性細(xì)胞因子水平。RSV A2株攻毒后，通過檢測小鼠體重變化、病毒載量等指標(biāo)判定重組RSV-F NPs免疫保護(hù)效果。
　　結(jié)果：構(gòu)建質(zhì)粒及桿粒位置大小正確，純度適當(dāng)。重組病毒DNA大小正確病毒最佳接種MOI為0.1，獲得重組病毒F-opt毒力為10

10、9TCID50/ml。WB鑒定65KD處有特異性條帶，證明重組RSV F蛋白的表達(dá)。電鏡觀察納米顆粒結(jié)構(gòu)形態(tài)完整呈―玫瑰花‖狀，證明納米顆粒組裝成功。滴鼻免疫BABL/c小鼠，試驗(yàn)結(jié)果顯示：二免后10μg NPs低劑量組、30μg NPs高劑量組的特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體效價(jià)均有明顯升高，30μg NPs高劑量組二次免疫IgG效價(jià)達(dá)到103.682±0.05，明顯高于10μg NPs低劑量組(P＜0.001)。IgG1/I

11、gG2a＜1，表明重組RSV F NPs疫苗株能夠產(chǎn)生偏向Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。與肌肉免疫組比較，滴鼻免疫組小鼠產(chǎn)生sIg A型特異性抗體，30μg NPs高劑量組鼻灌洗液效價(jià)達(dá)到101.7±0.03、肺灌洗達(dá)到102.3±0.7。體外中和實(shí)驗(yàn)證明RSV F NPs疫苗能夠激發(fā)小鼠產(chǎn)生中和抗體，30μg NPs高劑量組中和抗體效價(jià)達(dá)到102±0.13。檢測脾細(xì)胞分泌的 IFN-γ及 IL-4細(xì)胞因子顯著升高。攻毒后，免疫組的小鼠鼻肺病毒

12、載量降低、小鼠體重?zé)o明顯變化、肺部病理變化不明顯、IL-4細(xì)胞因子無明顯升高，初步說明疫苗沒有造成ERD。
　　結(jié)論：成功制備重組RSV-F NPs疫苗。動(dòng)物試驗(yàn)證明重組RSV-F NPs疫苗能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生有效的黏膜免疫、細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答，能夠產(chǎn)生中和抗體，證明重組RSV-F NPs疫苗具有良好的免疫原性，攻毒試驗(yàn)證明重組RSV-F NPs疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果。
　　二、重組嵌合FLU/RSV/NA-3F疫

13、苗株制備及免疫效果研究
　　本研究利用冷適應(yīng)流感病毒作為嵌合疫苗的載體，制備重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗。通過免疫 BABL/c小鼠，對重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行評價(jià)。
　　目的：制備重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗，評價(jià)重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗的免疫原性及免疫保護(hù)性，為研制安全、有效的重組RSV減毒活疫苗株提供數(shù)據(jù)支持。
　

14、　方法：利用生物信息學(xué)方法，對 A/California/07/2009（H1N1）株 NA基因進(jìn)行改造，并將RSV F蛋白的中和表位II重復(fù)三次后通過柔性氨基酸連接，插入NA基因序列中，組成重組NA-3F目的基因。重組質(zhì)粒與A/California/07/2009(H1N1）的 HA及 A/Ann Arbor/6/60(H2N2)的6質(zhì)粒共組成八質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染MDCK/COS1細(xì)胞后得到重組FLU/RSV/NA-3F病毒。經(jīng)雞胚傳代擴(kuò)增，

15、得到穩(wěn)定傳代的候選疫苗株。通過血凝實(shí)驗(yàn)、TCID50、Western blot、電鏡等方法對重組 FLU/RSV/NA-3F疫苗株進(jìn)行鑒定。純化重組 FLU/RSV/NA-3F疫苗株，104TCID50、106TCID50兩劑量組滴鼻免疫BABL/c小鼠，ELISA法檢測小鼠血清中特異性抗體及鼻肺灌洗液中sIgA抗體效價(jià)，HI檢測小鼠血清中針對流感的中和抗體，微量中和檢測針對RSV病毒的中和抗體，ELISPOT法檢測脾淋巴分泌細(xì)胞因子水

16、平。RSV A2株攻毒后，通過對小鼠體重變化、肺病毒載量及肺病理切片等指標(biāo)，評價(jià)重組FLU/RSV/NA-3F疫苗株的免疫保護(hù)性。被動(dòng)免疫后，用鼻肺病毒載量及肺病理切片評價(jià)疫苗的預(yù)防效果。
　　結(jié)果：構(gòu)建質(zhì)粒位置大小正確，純度適當(dāng)，測序完全正確。用于重組八質(zhì)?；蛐蛄姓_，并成功拯救出重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗株。Western blot鑒定63KD處有特異性條帶，證明嵌合蛋白的表達(dá)。電鏡觀察重組病毒結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)符

17、合流感病毒特征。純化病毒后血凝滴度為1：29，毒力為108TCID50/ml。體外復(fù)制結(jié)果證明重組 FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗株與 A/California/07/2009（H1N1）疫苗株具有相似的復(fù)制特性，最適溫度33℃。104TCID50、106TCID50兩劑量組滴鼻免疫BABL/c小鼠后，104TCID50、106TCID50兩劑量組均產(chǎn)生針對RSV的 IgG、IgG1、IgG2a型特異性抗體的升高，106TCID5

18、0高劑量二免后 IgG效價(jià)達(dá)到103.372±0.126，高于104TCID50低劑量組。IgG1/IgG2a＜1，表明重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗株能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生趨于Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫組小鼠產(chǎn)生明顯的sIg A型特異性抗體升高，106TCID50劑量組鼻灌洗液效價(jià)達(dá)到102.1±0.5，肺灌洗液效價(jià)達(dá)到102.9。微量中和實(shí)驗(yàn)表明重組FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗株能夠產(chǎn)生針對RSV的中和抗體，中和效價(jià)10

19、1.75±0.053；HI實(shí)驗(yàn)表明能夠產(chǎn)生針對流感病毒的中和抗體，效價(jià)達(dá)到1:640。檢測脾細(xì)胞分泌的 IFN-γ及 IL-4細(xì)胞因子顯著升高。攻毒后，兩組小鼠的鼻肺病毒載量均降低，106TCID50高劑量組小鼠鼻組織中的病毒載量為101.147±0.02，小鼠肺組織中的病毒載量為102.181±0.02。小鼠體重?zé)o明顯變化、肺部無明顯病理變化，IL-4細(xì)胞因子無明顯升高，沒有出現(xiàn)ERD癥狀。被動(dòng)免疫中，小鼠肺組織研磨液中的病毒載量為1

20、03.1±0.015。
　　結(jié)論：成功制備重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗。動(dòng)物試驗(yàn)證明重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗能夠有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫、細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答，能夠產(chǎn)生中和抗體，證明重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗具有良好的免疫原性。攻毒試驗(yàn)證明重組嵌合FLU/RSV/NA-3F減毒活疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果。被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)證明免疫血清在減少RSV肺中的復(fù)制、肺組織病變方面發(fā)揮