鼠疫耶爾森氏菌新型候選DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效果鑒定.pdf

1、鼠疫桿菌(Yersiniapestis)是腺鼠疫、敗血癥鼠疫和肺鼠疫的自然疫源性病原，曾經(jīng)以“瘟疫”的形式給人類的健康造成了極大的危害，歷史上共造成約2億人死亡，現(xiàn)在世界各地每年仍有鼠疫病例報(bào)道。由于生物恐怖襲擊事件的發(fā)生，已引起世界各國(guó)對(duì)鼠疫的高度警惕?？植酪u擊常采用氣溶膠感染，可直接引起原發(fā)性肺鼠疫流行，因而更需要研究安全有效的鼠疫疫苗。傳統(tǒng)的鼠疫疫苗包括滅活全菌體死疫苗、減毒活疫苗。雖然滅活全菌體死疫苗在預(yù)防腺型鼠疫有一定效果，但

2、對(duì)肺型鼠疫無(wú)效；減毒活疫苗又具有潛在的毒性。 近年來(lái)，DNA疫苗由于能夠誘導(dǎo)出較好的體液免疫和細(xì)胞免疫而日益受到重視，被譽(yù)為疫苗的第三次革命。tPA信號(hào)肽可以促進(jìn)異種蛋白的分泌表達(dá)，增強(qiáng)表達(dá)抗原的免疫原性。本文對(duì)鼠疫耶爾森氏菌新型DNA疫苗進(jìn)行了初步研究，選取鼠疫菌保護(hù)性抗原F1、V蛋白編碼基因和人tPA信號(hào)肽為研究對(duì)象，PCR擴(kuò)增鼠疫菌F1和V編碼基因，分別與克隆載體pGEM-T連接后測(cè)序，將測(cè)序正確的片段與真核表達(dá)質(zhì)粒pVA

3、X1連接，分別構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1/F1、pVAX1/V和pVAX1/F1-V，擴(kuò)增tPA信號(hào)肽，分別插入到F1、V和F1-V目的基因的上游，構(gòu)建分泌型重組真核表達(dá)質(zhì)粒tPA-pVAX1/F1、tPA-pVAX1/V和tPA-pVAX1/F1-V。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，細(xì)胞免疫化學(xué)方法和Westernblot方法鑒定結(jié)果顯示重組質(zhì)?？杀磉_(dá)F1、V和F1-V蛋白。在此基礎(chǔ)上，重組質(zhì)粒分別加細(xì)胞因子佐劑GM-CSF免疫BAL

4、B/c小鼠，每組10只，并設(shè)PBS組為陰性對(duì)照，100μg/只，雙側(cè)股四頭肌肌肉注射，隔周免疫一次，加強(qiáng)免疫3次，檢測(cè)細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)，ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中總IgG水平，免疫組顯著高于PBS對(duì)照組(P＜0.01)，在初次免疫后tPA-pVAX1/V和tPA-pVAX1/F1-V組可以誘導(dǎo)出較高的抗體水平，而其它組要至少二次免疫后才能達(dá)到相應(yīng)水平?？贵w亞型分類檢測(cè)結(jié)果顯示tPA-pVAX1/V和tPA-pVAX1/F1-V組

5、的IgG2a水平顯著提高，說(shuō)明分泌型tPA-V和tPA-F1-VDNA疫苗免疫在機(jī)體內(nèi)成功地增強(qiáng)了Th1型細(xì)胞免疫為主的免疫應(yīng)答。ELISPOT方法檢測(cè)了特異性活化的可以分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)，免疫組小鼠形成斑點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)均顯著多于PBS對(duì)照組(P＜0.01)，以tPA-pVAX1/V和tPA-pVAX1/F1-V免疫組為著。鼠疫菌強(qiáng)毒株皮下注射攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所構(gòu)建候選DNA疫苗對(duì)400LD50劑量均可產(chǎn)生部分保護(hù)，tP

6、A-pVAX1/V和tPA-pVAX1/F1-V最高可達(dá)90％。 本研究成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1/F1、pVAX1/V和pVAX1/F1-V以及分泌型表達(dá)質(zhì)粒tPA-pVAX1/F1、tPA-pVAX1/V和tPA-pVAX1/F1-V，在國(guó)內(nèi)尚屬首次，其中融合雙價(jià)表達(dá)質(zhì)粒pVAX1/F1-V和tPA-pVAX1/F1-V在國(guó)際上未見(jiàn)報(bào)道。所構(gòu)建重組質(zhì)粒具有誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的能力，tPA信號(hào)肽序列顯著增強(qiáng)了