細(xì)胞骨架重塑在機(jī)械牽伸誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞分化過程中的作用研究.pdf

1、體內(nèi)的肌腱由于經(jīng)常承受著巨大的力學(xué)載荷，損傷是很常見的。由于肌腱自身再生能力較差，恢復(fù)損傷肌腱正常的結(jié)構(gòu)和功能是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域目前最具挑戰(zhàn)的一個(gè)問題。隨著干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，特別是近年來肌腱干細(xì)胞(tendon stem cells，TSCs)的發(fā)現(xiàn)，研究者對(duì)慢性肌腱損傷的發(fā)病機(jī)制和肌腱損傷的治療修復(fù)有了新的認(rèn)識(shí)。
　　和肌腱一樣，位于其內(nèi)部的TSCs也必然會(huì)承受各種力學(xué)負(fù)荷。一項(xiàng)體外研究發(fā)現(xiàn):TSCs的分化與加載的力學(xué)負(fù)荷強(qiáng)度相關(guān):適度

2、的力學(xué)牽拉牽伸刺激可以促進(jìn)TSCs向肌腱細(xì)胞分化;過度的力學(xué)牽伸刺激則會(huì)導(dǎo)致TSCs向非肌腱細(xì)胞（脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞）方向分化。然而，TSCs成肌腱和非成肌腱細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　不同的機(jī)械牽伸可以導(dǎo)致TSCs發(fā)生不同的形變。維持細(xì)胞形態(tài)對(duì)細(xì)胞的功能至關(guān)重要，而維持細(xì)胞形態(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)是細(xì)胞骨架。細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)部緊密聯(lián)系的不同蛋白纖維和各種調(diào)控蛋白構(gòu)成的網(wǎng)架體系，對(duì)細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)起到支撐作用，在細(xì)胞伸展

3、、生長、對(duì)外界環(huán)境反應(yīng)以及分化等生理過程中，均扮演著極其重要的角色。目前，人們對(duì)于細(xì)胞力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制仍然缺乏較深入的認(rèn)識(shí)，但是有一個(gè)普遍認(rèn)同的事實(shí)就是:細(xì)胞骨架在建立細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的物理-化學(xué)信號(hào)聯(lián)系及轉(zhuǎn)換上起著至關(guān)重要的作用。
　　基于上述基礎(chǔ)，我們推測(cè)在機(jī)械牽伸誘導(dǎo)的TSCs分化過程中細(xì)胞骨架重塑可能發(fā)揮了重要的作用，不同的機(jī)械牽伸導(dǎo)致TSCs細(xì)胞骨架發(fā)生了不同的變化，進(jìn)而誘導(dǎo)TSCs向不同的方向分化。因此，本研究將試圖

4、明確不同機(jī)械牽伸對(duì)TSCs分化及細(xì)胞骨架的影響，以及細(xì)胞骨架變化在牽拉誘導(dǎo)分化這一過程中的作用。
　　目的:
　　(1)驗(yàn)證明確不同機(jī)械牽伸對(duì)TSCs分化的影響;
　　(2)觀察不同機(jī)械牽伸對(duì)TSCs細(xì)胞骨架重塑的影響;
　　(3)探討分析細(xì)胞骨架變化在牽拉誘導(dǎo)TSCs分化過程中的作用。
　　方法:
　　(1)不同機(jī)械牽伸對(duì)TSCs分化的影響:設(shè)定不同的機(jī)械牽伸條件（1HZ;牽伸強(qiáng)度為4％和8％;牽伸

5、累積總時(shí)間為12h，24h，60h），模擬TSCs體內(nèi)單軸循環(huán)牽伸，通過RT-PCR技術(shù)對(duì)牽伸后TSCs成腱分化相關(guān)標(biāo)志基因(Colla1、Tnc、Scx)和成脂分化相關(guān)標(biāo)志基因（PPARγ、LPL、ap2）的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。
　　(2)不同機(jī)械牽伸對(duì)TSCs細(xì)胞骨架重塑的影響:設(shè)定不同的機(jī)械牽伸條件(1HZ;牽伸強(qiáng)度為4％和8％;牽伸累積總時(shí)間為12h，24h，60h)，模擬TSCs體內(nèi)單軸循環(huán)牽伸，將牽伸后的細(xì)胞制作成細(xì)胞爬

6、片，采用F-actin免疫熒光染色以及Western blot檢測(cè)F-actin/G-actin比值來觀察不同牽伸條件下TSCs細(xì)胞骨架的變化。
　　(3)抑制細(xì)胞骨架重塑對(duì)TSCs分化的影響:篩選出Cyt-D的適用濃度，在TSCs成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)、成肌腱誘導(dǎo)牽伸，以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中，加入Cyt-D抑制肌動(dòng)蛋白聚合，破壞細(xì)胞骨架的重塑，通過定量RT-PCR和Western blot技術(shù)對(duì)Cyt-D干擾后TSCs成脂和成腱

7、分化相關(guān)標(biāo)志基因、蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　(1) Colla1、Tnc、Scx基因mRNA的表達(dá)在頻率1HZ，4％的牽拉應(yīng)力載荷時(shí)，三個(gè)牽拉累積總時(shí)間點(diǎn)均增加（P＜0.05）;而8％的牽拉應(yīng)力載荷初期(12h)可使上述基因的mRNA表達(dá)略有增加，但隨著牽拉累積時(shí)間的延長(60h)，上述基因的mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。PPARγ、LPL、ap2基因mRNA的表達(dá)在頻率1HZ，4％的牽拉應(yīng)力載荷早期

8、(12h，24h)無明顯變化，但隨著牽拉累積時(shí)間的延長(60h)，上述基因的mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）;而8％的牽拉應(yīng)力載荷則是均導(dǎo)致PPARγ、LPL、ap2基因mRNA的表達(dá)上升(P＜0.05)。
　　(2)4％的牽拉應(yīng)力載荷時(shí)，相比較于對(duì)照組，TSCs的細(xì)胞骨架F-actin增粗，熒光增強(qiáng)，F(xiàn)-actin/G-actin比值增加(P＜0.05)，且在一定的增加范圍內(nèi)可以與牽伸時(shí)間呈正相關(guān)。而8％的過度牽拉應(yīng)力，牽伸

9、12h時(shí)，表現(xiàn)為細(xì)胞骨架F-actin熒光增強(qiáng)，F(xiàn)-actin/G-actin比值增大，但是細(xì)胞骨架F-actin的伸展性較對(duì)照組有所降低;隨著總累積牽拉時(shí)間的增加(24h、60h)，細(xì)胞骨架F-actin熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?，?xì)胞伸展性明顯減小，變圓，F(xiàn)-actin/G-actin比值也明顯下降(P＜0.05)。
　　(3) Cyt-D可以有效的抑制細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的聚合。在TSCs成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)，以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中，使

10、用Cyt-D抑制細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白聚合會(huì)促使PPARγ、LPL、ap2的mRNA表達(dá)上升(P＜0.05);而在TSCs成肌腱誘導(dǎo)牽伸，以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中，使用Cyt-D抑制細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白聚合Colla1、Tnc、Scx的mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)不同的牽伸條件可使TSCs傾向于不同的系譜方向分化:適度的機(jī)械牽拉載荷促使TSCs傾向于成腱分化，而過度的機(jī)械牽拉載荷促使TSCs傾向于成

11、脂分化。
　　(2)不同的牽伸條件會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架出現(xiàn)不同的重塑適度的機(jī)械牽拉載荷促使TSCs細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白聚合增加，而過度的機(jī)械牽拉載荷則會(huì)導(dǎo)致TSCs細(xì)胞骨架F-actin斷裂、解聚。
　　(3)抑制細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白聚合會(huì)促進(jìn)TSCs成脂分化，并導(dǎo)致適度機(jī)械牽伸對(duì)TSCs成腱分化的誘導(dǎo)效應(yīng)消失，抑制TSCs成肌腱細(xì)胞分化。
　　(4)在機(jī)械牽伸誘導(dǎo)的TSCs分化過程中，細(xì)胞骨架的變化起著非常重要的作用，它不是伴隨著