銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的為神經(jīng)樣細(xì)胞及JAK-STAT3通路在細(xì)胞分化過(guò)程中作用的研究.pdf

1、目的：研究銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)效應(yīng)并探討細(xì)胞分化與JAK/STAT3通路的關(guān)系。
　　方法：將四周齡SD大鼠(雌雄不限)，頸椎脫臼處死，在無(wú)菌條件下，分離股骨和脛骨，沖洗骨髓腔制成單細(xì)胞懸液，利用密度梯度離心法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度接種入含胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于細(xì)胞培

2、養(yǎng)箱內(nèi)。按照貼壁培養(yǎng)法7-8天后傳代，傳至第3代后，應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。然后將純化的BMSCs分為3組：1、銀含內(nèi)酯B(GB)組，使用銀杏內(nèi)酯B(40mg/L)處理。2、AG490組，加用JAK/STAT3通路抑制劑AG490(5μmol/L)處理。3、對(duì)照組，不做任何處理。培養(yǎng)7天后，于光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，采用全細(xì)胞記錄方式，對(duì)誘導(dǎo)前后的細(xì)胞進(jìn)行電生理功能測(cè)定；采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法分別檢測(cè)巢蛋白(Ne

3、stin)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的情況，并計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分率；采用WesternBlot法對(duì)GB組和AG490組的STAT3及P-STAT3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。最后采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行資料分析。
　　結(jié)果：1.體外純化培養(yǎng)BMSCs，在其傳至3代后，細(xì)胞突起逐漸增多，細(xì)胞間可相互連接，并形成網(wǎng)狀，細(xì)胞表現(xiàn)為輻射狀、旋渦狀排列。經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)鑒定，CD90，CD29，CD34

4、，CD45表達(dá)分別為94.6％，87.6％，0.02％，3.71％。2.經(jīng)銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)7天后，細(xì)胞發(fā)生改變，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞體收縮變圓，突起增多，折光性增強(qiáng)，繼續(xù)誘導(dǎo)可見(jiàn)細(xì)胞間形成網(wǎng)絡(luò)連接。3.在全細(xì)胞電壓鉗記錄模式下，可記錄到一系列內(nèi)向電流，銀杏內(nèi)酯B組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞峰值電流增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.各組細(xì)胞免疫熒光結(jié)果：銀杏內(nèi)酯B組及AG490組中GFAP，NSE，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞率較空白對(duì)照組均增多

5、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AG490組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞率較銀杏內(nèi)酯B組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AG490組中NSE、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別較銀杏內(nèi)酯B組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5.Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AG490組的P-STAT3的表達(dá)較銀杏內(nèi)酯B組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.在體外培養(yǎng)中，銀杏內(nèi)酯B可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞。