Myocardin基因沉默在PDGF-BB誘導間充質干細胞向平滑肌樣細胞分化過程中的作用.pdf

1、背景:動脈粥樣硬化是動脈硬化的血管病中最常見、最重要的一種疾病。在國內外均是一種嚴重危害人類健康的常見疾病,并隨著生活條件的改善動脈粥樣硬化性疾病日趨高發(fā),呈年輕化發(fā)展趨勢。自從1904年德國萊比錫病理學家Marchand首次提出動脈粥樣硬化一詞以來,學者就一直在探索動脈粥樣硬化的發(fā)病機制,可以肯定的是血管平滑肌細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中占據著重要地位。隨著干細胞這門新興學科的發(fā)展,使得在這古老的疾病認識上有了新的補充。在這個背景下

2、本實驗結合干細胞技術和基因調控技術做出探索。
　　目的:構建myocardin特異性shRNA(short hairpin RNA)真核表達載體,體外觀察其對myocardin基因的沉默效應及對小鼠骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)向平滑肌樣細胞分化過程中的影響。
　　方法:分離并培養(yǎng)小鼠骨髓間充質干細胞;利用血小板源性生長因子(platelet-derived growth facto

3、r,PDGF-BB)聯(lián)合高濃度胎牛血清(20％FBS)誘導小鼠骨髓間充質干細胞向平滑肌樣細胞分化;構建含u6啟動子和myocardin特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)編碼序列的真核表達載體pGen-myo-shRNA為干擾質粒以及含非特異性shRNA編碼序列的質粒載體pGenesil-Con(pCon)為陰性對照質粒。將誘導培養(yǎng)8天后的間充質干細胞分做以下三個實驗組:一是空白對照組,只加入轉染試劑 Lipofectamine2000;二

4、是陰性對照組,加入轉染試劑Lipofectamine2000和陰性對照質粒(pCon);三是干擾組,加入轉染試劑和pGen-myo-shRNA干擾質粒。分別于轉染48h后用RT-PCR技術檢測細胞內myocardin mRNA表達的變化;同時用免疫組化方法檢測細胞平滑肌肌球蛋白重鏈(SM myosin heavy chain, SM-MHC)的表達及結合細胞形態(tài)學改變來鑒定平滑肌樣細胞的分化。
　　結果:經過測序鑒定,成功地構建了

5、myocardin特異性 shRNA真核表達載體pGen-myo-shRNA。并且pGen-myo-shRNA干擾質粒體外成功轉染小鼠間充質干細胞后,RT-PCR結果顯示:干擾組細胞(0.411±0.013)較空白對照組(0.719±0.017) myocardin mRNA表達下調42.86%,其差異有顯著統(tǒng)計學意義(P﹤0.05),陰性對照組細胞較空白對照組而言表達無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05);同時免疫組化結果也表明

6、:干擾組細胞 SM-MHC陽性表達水平(195.73±5.08)低于空白對照組(171.37±6.52),差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05),陰性對照組和空白對照組之間無明顯差異,差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。
　　結論:小鼠骨髓間充質干細胞在PDGF-BB及高濃度胎牛血清誘導培養(yǎng)下可表達平滑肌細胞晚期標志基因SM-MHC和發(fā)生近似平滑肌細胞的形態(tài)學改變,說明小鼠骨髓間充質干細胞具有向平滑肌樣細胞分化的潛能;構建的pGen-my