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文檔簡介
1、第一部分:腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對PC-12神經(jīng)細胞活性的影響及其可能機制
目的:觀察外源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)對PC-12神經(jīng)細胞的影響及可能機制。
方法:體外培養(yǎng)高分化的PC-12神經(jīng)細胞,經(jīng)胰酶溶解計數(shù)后均勻接種于96孔板并分為2組:BDNF組:分別加入125μg.L-1,250μg.L-1,500μg.L-1及1000μg.L-1BDN
2、F處理;對照組:加入相同劑量的溶劑。觀察給藥處理24h后PC-12細胞的數(shù)量變化。并以磺基羅丹明B法(sulforhodamine B,SRB)檢測PC-12細胞的存活率。另取上述細胞于給藥后24h固定,采用免疫熒光法檢測細胞泛素結(jié)合蛋白P62/SQSTM1的表達變化。
結(jié)果:1.給藥24h后神經(jīng)細胞存活率的變化:與對照組相比,125μg.L-1BDNF組,250μg.L-1BDNF組,500μg.L-1BDNF組細胞存活率無
3、明顯變化(P>0.05),1000μg.L-1BDNF組細胞存活率明顯減低(P<0.05)。2.給藥24h后細胞內(nèi)P62的變化:免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組對比,BDNF各劑量組細胞內(nèi) P62表達均減少(P<0.05),而1000μg.L-1BDNF組細胞內(nèi)P62蛋白減少最明顯。
結(jié)論:1000μg.L-1BDNF可致神經(jīng)細胞存活率明顯減低,可能與細胞自噬強度增加有關(guān)。
第二部分:PIK3C3 siRNA-pool抑制
4、大鼠PC-12神經(jīng)細胞P62/SQSTM1的表達
目的:探索可高效抑制大鼠 PC-12神經(jīng)細胞上磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PIK3C3)表達的小干擾 RNA(small interferenceRNA,siRNA)的使用劑量及作用時間,并觀察其對PC-12細胞自噬的調(diào)節(jié)作用。
方法:設(shè)計并合成針對 PIK3C3的 siRNA3對(siRNA125、siRNA94
5、3、siRNA2283)及一條帶綠色熒光標記的陰性對照 FAM-siRNA。在 Lipofectamine2000介導下轉(zhuǎn)染 PC-12細胞。PC-12細胞隨機分為 Normal組,Vehicle組,Mismatch組,PIK3C3siRNA25nmol.L-1組、50nmol.L-1組、100nmol.L-1組。轉(zhuǎn)染6h后,于熒光顯微鏡下計算轉(zhuǎn)染復合物的轉(zhuǎn)染效率,使用 MTT法檢測轉(zhuǎn)染復合物的細胞毒性,采用real-time PCR法
6、測定siRNA-pool的抑制率,采用細胞免疫化學的方法檢測細胞泛素結(jié)合蛋白P62/SQSTM1的表達變化。
結(jié)果: siRNA轉(zhuǎn)染效率可隨載體使用劑量的增加而升高。轉(zhuǎn)染復合物的細胞毒性低,各組細胞成活率差異無統(tǒng)計學意義。PIK3C3siRNA50nmol.L-1組、siRNA100nmol.L-1組可抑制PIK3C3的表達,siRNA100nmol.L-1組干擾PC-12細胞后,PIK3C3mRNA相對表達量較低。siRNA
7、100nmol.L-1組轉(zhuǎn)染 PC-12細胞48h后,P62/SQSTM1的相對表達量升高。
結(jié)論:siRNA100nmol.L-1組能有效地抑制PC-12上PIK3C3mRNA的表達,且引起自噬有關(guān)蛋白P62/SQSTM1的表達升高,抑制PC-12細胞的自噬。
第三部分:PIK3C3siRNA通過抑制自噬的過度激活對BDNF致大鼠神經(jīng)細胞損傷的保護作用
目的:觀察預給予PIK3C3siRNA轉(zhuǎn)染PC-12
8、細胞對大劑量外源性BDNF對神經(jīng)細胞損傷的保護作用及其可能機制。
方法:將體外培養(yǎng)的PC-12細胞分為六組,分別為:Normal組(N組),Vehicle組(V組),Mismatch組(M組)組,BDNF組(B組),PIK3C3siRNA組(S組),BDNF+PIK3C3siRNA100nmol.L-1組(BS組)。其中B組及BS組BDNF濃度為1000μg.L-1,BS組轉(zhuǎn)染試劑PIK3C3siRNA于實驗前24h以100n
9、mol.L-1的濃度轉(zhuǎn)染細胞后再加入1000μg.L-1BDNF作用24h。通過MTT法(n=5)檢測PC-12神經(jīng)細胞活性的變化、real-time PCR法(n=3)檢測與自噬有關(guān)的P62/SQSTM1基因及LC3基因的表達、細胞免疫化學(n=4)、細胞免疫熒光(n=4)法在蛋白水平上檢測P62/SQSTM1蛋白及LC3蛋白的表達變化。
結(jié)果:細胞活性變化:與N組比較,B組神經(jīng)細胞存活率明顯下降(P<0.01),其他各組細
10、胞存活率變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與 B組相比,BS組神經(jīng)細胞活力明顯增加(P<0.01)。real-time PCR結(jié)果顯示:與N組相比,B組P62/SQSTM1mRNA相對表達量下降(P<0.01),LC3mRNA相對表達量則增高(P<0.01),S組P62/SQSTM1mRNA相對表達量增高(P<0.05),LC3mRNA相對表達量則下降(P<0.05),BS組P62/SQSTM1基因相對表達量下降(P<0.05),LC3
11、mRNA相對表達量則高于N組(P<0.01),V組與M組基因表達水平與N組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與B組相比,BS組P62/SQSTM1mRNA相對表達量增高(P<0.01),LC3mRNA相對表達量則下降(P<0.05)。細胞免疫化學與免疫熒光結(jié)果顯示:與N組相比,B組P62/SQSTM1蛋白表達減少(P<0.01),LC3蛋白表達增高(P<0.01),S組P62/SQSTM1蛋白表達增高(P<0.01),LC3蛋白表
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