腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的重構(gòu)作用.pdf

1、背景：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員之一。在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，BDNF通過與其高親和力受體酪氨酸激酶受體B(tropomyosin-related kinase B，TrkB)結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育、再生、修復(fù)、突觸重構(gòu)等生理作用。近年來，BDNF對胃腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)作用引起越來越多的關(guān)注。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明BDNF可以增加健康成年人的排便頻率及

2、增強(qiáng)大鼠粘膜刺激引起的離體結(jié)腸蠕動(dòng)反射。結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(smoothmuscle cell,SMC)作為結(jié)腸收縮的重要效應(yīng)器官，BDNF對其是否有重構(gòu)作用尚未見報(bào)道。
　　目的：
　　本研究通過引入BDNF基因敲除（BDNF+/-）小鼠，觀察BDNF+/-小鼠結(jié)腸SMC超微結(jié)構(gòu)的改變及結(jié)腸組織平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(smooth muscleα-actin，α-SMA)表達(dá)水平的變化，并應(yīng)用BDNF和TrkB受體阻滯劑(K252

3、a)體外干預(yù)C57bl/6小鼠結(jié)腸SMC，檢測SMC形態(tài)及α-SMA、相關(guān)信號通路蛋白、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，研究BDNF是否可以直接引起小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的重構(gòu)，進(jìn)而影響腸道動(dòng)力。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)選用健康野生型C57B1/6(BDNF+/+)小鼠和BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠:電鏡檢測BDNF+/+小鼠和BDNF+/-小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異;利用Western blotting方法檢測BDN

4、F+/-小鼠和BDNF+/+小鼠α-SMA表達(dá)水平的差異。
　　2.培養(yǎng)原代小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞:細(xì)胞免疫熒光鑒定原代結(jié)腸SMC是否有TrkB受體的表達(dá);BDNF及K252a分別干預(yù)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞，根據(jù)干預(yù)不同，分為三組①對照組②BDNF組③BDNF+ K252a組，三組細(xì)胞均于干預(yù)24小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);細(xì)胞免疫熒光檢測BDNF及K252a干預(yù)后結(jié)腸平滑肌細(xì)胞形態(tài)的改變;Western blotting檢測干預(yù)后SMC中α-SMA

5、，TrkB-PLC-Ca2+信號通路蛋白表達(dá)量的變化;鈣離子成像檢測BDNF和K252a干預(yù)下SMC中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬時(shí)改變。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料以(x)+s表示。BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠結(jié)腸組織α-SMA表達(dá)水平、干預(yù)前后細(xì)胞內(nèi)鈣離子相對熒光強(qiáng)度值的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);BDNF和K252a干預(yù)SMC，對照組、BDNF組及BDNF+K252a組細(xì)胞核大小、細(xì)胞密度、α-SM

6、A表達(dá)水平、TrkB信號通路蛋白表達(dá)水平總體采用單因素方差分析，若總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.與BDNF+/+小鼠相比，BDNF+/-小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞細(xì)胞間隙增寬，充填了大量的膠原纖維;平滑肌細(xì)胞的邊界呈多個(gè)球狀突起;胞體內(nèi)肌絲的密度減少;
　　2.與BDNF+/+小鼠相比，BDNF+/-小鼠結(jié)腸α-SMA表達(dá)水平明顯降低;

7、r>　　3.小鼠原代結(jié)腸SMC表達(dá)TrkB受體;
　　4.在BDNF作用下，免疫熒光結(jié)果顯示SMC細(xì)胞核體積增大，細(xì)胞密度增加，骨架蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，BDNF+K252a干預(yù)組細(xì)胞的形態(tài)改變相反;
　　5.BDNF組SMC中α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組和BDNF+K252a組;
　　6.BDNF組結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中TrkB-PLC-Ca2+信號通路蛋白表達(dá)水平明顯升高，且在BDNF干預(yù)下SMC內(nèi)鈣離子濃度明顯升高