腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，不僅在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，在哺乳動物的卵巢中也表達(dá)。研究表明，BDNF對哺乳動物卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育起重要作用。本研究旨在探討B(tài)DNF對水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響，并對其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，以期進(jìn)一步優(yōu)化卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系，提高胚胎體外生產(chǎn)的效率。
　　1.水牛BDNF基因克隆、序列分析及其在不同組織中的表達(dá)模式。測序結(jié)果顯示，克隆獲得的水牛BDNF基

2、因全長800bp，編碼區(qū)753bp，編碼250個氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列與多個物種的同源性都很高;蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示，BDNF定位在細(xì)胞內(nèi)且為含有信號肽序列的分泌型蛋白，其三級結(jié)構(gòu)由多個α-螺旋、3對反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)等構(gòu)成活性中心，即NGF功能結(jié)構(gòu)域;qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，BDNF在胎兒及成年水牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、皮膚、肌肉、卵巢、睪丸10種組織中均有表達(dá)，在卵巢上高表達(dá);受體TrkB、p75在胎兒

3、及成年水牛各組織中的表達(dá)模式與BDNF并不完全一致，但TrkB在卵巢中高表達(dá)，而p75在卵巢中表達(dá)很低。
　　2.BDNF及其受體在水牛卵泡、卵母細(xì)胞及早期胚胎中的表達(dá)模式。利用免疫組化、ELISA、免疫熒光染色及qRT-PCR等方法的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BDNF在水牛卵泡發(fā)育各時期均有表達(dá)，且主要在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及卵丘細(xì)胞中表達(dá)，同時在直徑4＜Φ≤7mm的卵泡中，卵泡液BDNF濃度、卵泡顆粒細(xì)胞BDNF mRNA及TrkB mRN

4、A的表達(dá)水平均最高，Φ＞7mm的次之，2≤Φ≤4mm的最低，且存在顯著性差異(P＜0.05)，而p75 mRNA表達(dá)水平很低;水牛COCs在體外成熟過程中(0h、6h、12h、24 h)，BDNFmRNA在卵母細(xì)胞及卵丘細(xì)胞上表達(dá)呈逐漸上升趨勢，TrkB mRNA在卵丘細(xì)胞上表達(dá)呈先上升后下降趨勢，但在卵母細(xì)胞上不表達(dá)，p75 mRNA在卵母細(xì)胞及卵丘細(xì)胞上表達(dá)呈先降低后快速上升趨勢;水牛早期胚胎在發(fā)育過程中（2cell、4cell、8

5、cell、桑椹胚、囊胚），BDNF mRNA表達(dá)呈先上升后下降趨勢，4cell表達(dá)最高，p75 mRNA表達(dá)呈逐漸下降趨勢，2cell表達(dá)最高，BDNF及p75在桑椹胚及囊胚表達(dá)都很低，而TrkB在胚胎發(fā)育過程中不表達(dá)。
　　3.BDNF對水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響及其作用機(jī)制。在體外成熟液中添加10ng/ml的BDNF能顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率(59.07％ vs48.96％，P＜0.05)及隨后IVF早期胚胎的囊胚率（23.2

6、9％ vs15.58％，P＜0.05），但對裸卵成熟無顯著影響（50.82％ vs50.86％，P＞0.05）;在體外成熟液中分別添加TrkB和p75的抑制劑K-252a與Pep-5，BDNF+K-252a組的成熟率顯著低于BDNF組(49.50％ vs60.01％，P＜0.05)，而BDNF+Pep5組的成熟率與BDNF組相比無顯著性差異（59.04％ vs60.01％，P＞0.05）;卵丘細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2、Cas

7、pase-3、Caspase-9、Fas、p53)、BDNF受體(TrkB、p75)及發(fā)育相關(guān)基因(CCNB1、COX2、Cx37、Cx43、CYP11A1、FSHR、HAS2、MAPK、PCNA、PGES、PTX3、TSG-6）表達(dá)的qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，BDNF能顯著下調(diào)Caspase-9、Fas的表達(dá)，上調(diào)TrkB、CCNB1、PCNA、Cx37、Cx43、HAS2、PTX3、TSG-6的表達(dá)。
　　以上結(jié)果表明:(1

8、)克隆獲得的水牛BDNF基因全長800bp，編碼區(qū)753bp，編碼250個氨基酸，在物種間具有高度保守性，且BDNF及其受體TrkB在水牛卵巢中高表達(dá);(2) BDNF在水牛卵泡發(fā)育各時期及不同直徑卵泡的卵泡液中均有表達(dá)，同時BDNF及p75在不同直徑的卵泡顆粒細(xì)胞、體外成熟過程中的卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞、以及早期發(fā)育階段的胚胎中均有表達(dá)，而TrkB僅在顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中高表達(dá)，在卵母細(xì)胞及早期胚胎中不表達(dá);(3)適宜濃度的BDNF(10