TNF--α調(diào)控SemaphorinⅢ家族蛋白參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松疾病中TNF-α通過JNK信號途徑上調(diào)Semaphorin3D蛋白表達誘導(dǎo)破骨細胞分化
　　一、目的：
　　本研究擬通過體內(nèi)及體外實驗，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用基因沉默及過表達等干預(yù)手段，篩選PMOP中參與TNF-α誘導(dǎo)破骨細胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明確SemaⅢ家族蛋白在TNF-α促進破骨細胞分化中的作用;探索TNF-α通過SemaⅢ家族蛋白促進破骨細胞

2、分化的作用。本研究的完成對于探索絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生機制、尋找新的治療靶點提供重要的理論依據(jù)。
　　二、方法：
　　1、培養(yǎng)正常小鼠來源的破骨細胞，通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)對破骨細胞形成的標志性基因（TRAP、c-Fos和NFATc-1）表達檢測等方法，明確TNF-α對破骨細胞分化的影響。
　　2、在TNF-α

3、促進RANKL誘導(dǎo)破骨細胞分化的過程中，通過qRT-PCR技術(shù)檢測SemaⅢ家族蛋白(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E)表達量的變化，并進一步檢測SemaⅢ家族蛋白受體(Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2)表達量的改變。
　　3、構(gòu)建假手術(shù)組（Sham operation，Sham）小鼠、去卵巢組(Ovariectomized，OVX)小鼠、OVX+PBS

4、小鼠及OVX+TNF-α中和性抗體（anti-TNF-α）小鼠模型，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)實驗檢測各組模型小鼠血清中TNF-α水平的變化，并通過微計算機斷層掃描技術(shù)(micro computed tomography，micro-CT)技術(shù)確定模型構(gòu)建是否成功。
　　4、通過TRAP染色觀察Sham組、OVX組、OVX+PBS組及OVX+anti-T

5、NF-α組小鼠股骨干骺端的破骨細胞數(shù)量變化。
　　三、結(jié)果：
　　1、TNF-α能夠增加TRAP陽性染色的破骨細胞數(shù)量，并且夠促進破骨細胞中TRAP,NFATc1和c-Fos基因的表達，提示TNF-α能夠促進RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞形成。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過作用于破骨細胞分化的早期階段促進破骨細胞的形成。
　　2、在TNF-α正向調(diào)控破骨細胞形成過程中SemaⅢ家族蛋白中的sema3D表達量增加最明顯，并且T

6、NF-α誘導(dǎo)的sema3D表達量的增加存在時間依賴性。此外，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α在促進破骨細胞分化的過程中SemaⅢ家族蛋白受體NPR1的表達量明顯減少，而Plx-A3的表達量輕微的減少。
　　3、過表達Sema3D后能夠明顯的促進RANKL誘導(dǎo)破骨細胞分化，而阻斷Sema3D后RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化明顯減少。此外，過表達Sema3D后能夠明顯的促進TNF-α正向調(diào)控RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化，而阻斷Sema3D后能夠緩解T

7、NF-α誘導(dǎo)的破骨細胞分化，提示Sema3D在TNF-α誘導(dǎo)破骨細胞分化的過程中具有重要功能。
　　4、TNF-α能夠明顯的促進破骨細胞前體細胞的增殖，而基因沉默Sema3D后能夠明顯緩解TNF-α誘導(dǎo)的破骨細胞前體細胞增殖，這些結(jié)果證明Sema3D介導(dǎo)了TNF-α對破骨細胞前體細胞增殖的調(diào)控。過表達或基因沉默Sema3D后并未影響細胞的凋亡。
　　四、結(jié)論：
　　1、TNF-α是導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中破骨細胞分化增加、

8、骨吸收增強的重要因素。雌激素缺乏后導(dǎo)致TNF-α水平升高，過量的TNF-α能夠促進RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化，并且這種誘導(dǎo)作用發(fā)生在破骨細胞分化的早期階段。
　　2、在TNF-α促進RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化過程中，Sema3D的表達量明顯增加。Sema3D的增加一方面通過促進破骨細胞前體細胞的增殖增加破骨細胞的數(shù)量，另一方面通過促進RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化影響破骨細胞的形成。
　　3、TNF-α通過激活JNK途徑上

9、調(diào)了Sema3D的表達。體內(nèi)抑制Sema3D能夠有效緩解OVX誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松。
　　第二部分:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中TNF-α通過抑制Wnt/β-catenin信號途徑下調(diào)Semaphorin3B表達抑制成骨細胞分化
　　一、研究目的：
　　本研究擬通過體內(nèi)及體外實驗，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用基因沉默及過表達等干預(yù)手段，篩選PMOP中參與TNF-α抑制BMMSCs向成骨細胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明確SemaⅢ家族蛋白

10、在TNF-α抑制BMMSCs向成骨細胞分化中的功能;探索TNF-α通過SemaⅢ家族蛋白抑制BMMSCs向成骨細胞分化的分子機制。本研究的完成有助于闡釋PMOP的發(fā)病機制，尤其是TNF-α相關(guān)的骨形成減少的分子機制。
　　二、研究方法：
　　1、培養(yǎng)正常小鼠骨髓來源的MSCs(BMMSCs)細胞，在TNF-α抑制BMSCs向成骨細胞分化的不同時間點(0天、3天、7天、14天)，通過qRT-PCR技術(shù)檢測SemaⅢ家族蛋白（S

11、ema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E）表達量的變化，并通過Western blot技術(shù)進一步驗證Sema3B在此過程中表達量的變化。
　　2、構(gòu)建Sham小鼠、OVX小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+anti-TNF-α小鼠模型，通過micro-CT技術(shù)確定模型構(gòu)建是否成功，通過Elisa實驗檢測各組模型小鼠血清中TNF-α水平的變化，并通過免疫組化技術(shù)觀察各組模型小鼠股骨干骺端TF-α表達量的變化。

12、
　　3、構(gòu)建TNF-α中和抗體抑制OVX誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的小鼠模型，免疫組化技術(shù)觀察各組模型小鼠股骨干骺端Sema3B表達量的變化，qRT-PCR技術(shù)檢測SemaⅢ家族蛋白受體(Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2)表達量的變化。
　　4、分離各組模型小鼠的BMMSCs，qRT-PCR技術(shù)檢測細胞中Sema3B表達量的變化。
　　三、結(jié)果：
　　1、TNF-α在抑制BMMSCs

13、向成骨細胞分化的過程中sema3A，sema3C，sema3D和sema3E的表達量并沒有發(fā)生明顯的變化，而sema3B的表達量明顯的減少且具有時間依賴性。
　　2、OVX組小梁骨密度(BMD)和靜態(tài)微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)(Tb.Th、BV/TV和Tb.N)明顯小于Sham組，OVX+anti-TNF-α組小鼠骨量相對于OVX組小鼠明顯增加。OVX組小鼠相對于Sham組小鼠小梁骨變細、數(shù)量減少，TNF-α中和抗體能夠緩解OVX引起的小鼠股骨

14、干骺端小梁骨結(jié)構(gòu)的變化。
　　3、OVX組小鼠TNF-α水平明顯高于Sham組小鼠，而應(yīng)用TNF-α中和抗體能夠有效地降低OVX組小鼠的TNF-α水平;OVX組小鼠相對于Sham組小鼠股骨干骺端TNF-α的表達明顯增加，而應(yīng)用TNF-α中和抗體能夠明顯減少TNF-α表達。
　　4、OVX組小鼠相對于Sham組小鼠股骨干骺端Sema3B的表達明顯減少，而OVX小鼠應(yīng)用TNF-α中和抗體后能夠明顯增加Sema3B的表達;相對于S

15、ham組小鼠，OVX組小鼠來源的BMMSCs(OVX-MSCs)中Sema3B的表達量明顯減少，而TNF-α中和抗體的應(yīng)用能夠明顯的增加OVX小鼠BMMSCs中Sema3B的表達。
　　四、結(jié)論：
　　1、TNF-α是導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松疾病中BMMSCs向成骨細胞分化抑制、骨形成減少的重要因素。在TNF-α抑制BMMSCs向成骨細胞分化過程中，Sema3B的表達量明顯減少。Sema3B表達量的降低一方面通過影響B(tài)MMSCs的

16、增殖來減少成骨細胞形成的數(shù)量，另一方面通過抑制BMMSCs細胞向成骨細胞分化影響骨形成。
　　2、TNF-α抑制MSCs細胞向成骨細胞分化的過程中，DKK-1，GSK-3β和β-catenin的蛋白表達量明顯降低，提示TNF-α能夠明顯的抑制MSCs細胞中Wnt/β-catenin信號途徑。而Wnt/β-catenin信號途徑的激活能夠明顯的緩解TNF-α對MSCs細胞中Sema3B表達的抑制作用，提示TNF-α通過抑制Wnt/β