成骨細(xì)胞形成及其異常調(diào)控導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的分子機制.pdf

1、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMO)是以絕經(jīng)后骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致骨脆性增加為特征的骨代謝性疾病。成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)骨形成與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)骨吸收間的動態(tài)平衡構(gòu)成了骨重建過程。在相應(yīng)誘導(dǎo)因素作用下，間充質(zhì)干細(xì)胞可分別向成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞分化。自然絕經(jīng)或去勢手術(shù)后女性由于性激素缺乏導(dǎo)致骨丟失增加，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率高于同齡男性。PMO主要與

2、性激素紊亂及免疫功能失調(diào)密切關(guān)聯(lián)。迄今為止，治療PMO的方法主要是預(yù)防骨吸收;絕經(jīng)后女性普遍應(yīng)用的雌激素替代療法也主要作用于骨吸收，但對成骨細(xì)胞分化及其生物學(xué)功能調(diào)控的研究報道甚少。
　　脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)是體內(nèi)最豐富的腎上腺來源的甾體激素前體，其生物學(xué)功能并不能完全歸結(jié)于其代謝產(chǎn)物。近來研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性DHEA水平低于正常人群，并主張應(yīng)用DHEA防治PMO。但DHEA對骨代謝

3、作用的生化和分子機制尚未闡明。本研究擬通過如下體內(nèi)外實驗，以解析間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的分子機制，免疫細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用，以及DHEA及補腎寧心中藥復(fù)方促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的機制，以評價DHEA或補腎寧心方在防治PMO中的作用機制。
　　第一部分間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的分子機制
　　目的探討小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的分子機制方法體外分離培養(yǎng)并鑒定小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干

4、細(xì)胞，應(yīng)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液處理;PCR檢測成骨細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，Osterix，Osteocalcein及特征性分子collagen1表達(dá);ALP染色鑒定成骨細(xì)胞，及細(xì)胞堿性磷酸酶活性比色法定量檢測ALP活性;Alizarin Red染色檢測骨礦化結(jié)節(jié)的形成。分析研究胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，PI3K抑制劑(LY294002)及mTOR途徑阻斷劑（Rapamycin）對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。體外分離

5、培養(yǎng)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，以成脂誘導(dǎo)條件處理后，PCR檢測脂肪細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ表達(dá)，Oil Red O染色計數(shù)脂肪細(xì)胞，并分別給予IGF-1，PI3K抑制劑及mTOR途徑阻斷劑，觀察其對間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果在成骨誘導(dǎo)條件下，成骨細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，Osterix，Osteocalcein及特征性分子collagen1表達(dá)增加;間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化;隨著培養(yǎng)時間的延長，形成骨礦化

6、結(jié)節(jié)。IGF-1促進(jìn)成骨細(xì)胞生成;PI3K抑制劑及mTOR途徑阻斷可阻斷IGF-1的作用。在成脂誘導(dǎo)液作用下，脂肪細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ表達(dá)增加，可形成成熟的脂肪細(xì)胞。IGF-1不影響脂肪細(xì)胞生成，PI3K抑制劑及阻斷mTOR途徑可增加脂肪細(xì)胞的生成。結(jié)論在成骨環(huán)境下間充質(zhì)干細(xì)胞可優(yōu)勢表達(dá)成骨細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，Osterix，Osteocalcein及特征性分子collagen1;從而分化為成骨細(xì)胞，IGF-1可通過

7、PI3K—mTOR途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。
　　第二部分免疫細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用
　　目的研究骨髓單核細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　方法體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓單核細(xì)胞，將骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，給予成骨細(xì)胞誘導(dǎo)條件處理，PCR檢測成骨細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，Osterix，Osteocalcein表達(dá)及特征性

8、分子collagen1，RANKL，OPG表達(dá);ALP染色鑒定成骨細(xì)胞并定量檢測ALP活性;Alizarin Red染色檢測骨礦化結(jié)節(jié)的形成。將骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后，給予成脂細(xì)胞誘導(dǎo)條件處理，PCR檢測脂肪細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ表達(dá)，Oil Red O染色計數(shù)脂肪細(xì)胞。體外分離培養(yǎng)小鼠脾臟Treg，將Treg與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，給予成骨細(xì)胞誘導(dǎo)條件處理，定量檢測ALP活性;Alizarin Red染色檢測骨礦化結(jié)節(jié)

9、的形成。分別以中和抗體阻斷Treg特征性細(xì)胞因子IL-10，TGFβ，CTLA-4或Transwell阻斷細(xì)胞間直接接觸，以解析Treg調(diào)節(jié)OB生成的分子基礎(chǔ)。將Treg與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，給予成脂細(xì)胞誘導(dǎo)液處理，PCR檢測脂肪細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ表達(dá)，Oil Red O染色計數(shù)脂肪細(xì)胞，觀察Treg對間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下，骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)抑制成骨細(xì)胞生成，結(jié)果

10、顯示骨髓單核細(xì)胞增加間充質(zhì)干細(xì)胞RANKL/OPG表達(dá);下調(diào)Osterix、Collagen1mRNA表達(dá);不影響Runx2與osteocalcin表達(dá);成骨細(xì)胞ALP活性下降;骨礦結(jié)節(jié)形成的數(shù)目顯著減少。在成脂誘導(dǎo)環(huán)境下，骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)不影響PPARγ mRNA表達(dá);對脂肪細(xì)胞的生成無顯著影響。Treg可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向OB分化，形成的成骨細(xì)胞ALP活性增強，骨礦結(jié)節(jié)數(shù)目增加。IL-10，TGFβ，CTLA-4中和

11、抗體或Transwell阻斷細(xì)胞間直接接觸，均部分抑制Treg對OB生成的促進(jìn)效應(yīng)。Treg不影響間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。
　　結(jié)論骨髓單核細(xì)胞可下調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞Osterix、Collagen1mRNA表達(dá)，從而抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并使生成的成骨細(xì)胞ALP活性下降;骨礦結(jié)節(jié)形成數(shù)目顯著減少。Treg可經(jīng)細(xì)胞間直接接觸或通過其可溶性細(xì)胞因子IL-10，TGFβ，及CTLA-4促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向OB分化，形成的成骨

12、細(xì)胞ALP活性增強，骨礦結(jié)節(jié)數(shù)目增加。但骨髓單核細(xì)胞及Treg均不影響間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)PPARγ mRNA;對脂肪細(xì)胞的生成無調(diào)控作用。
　　第三部分 DHEA促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的分子機制
　　目的觀察DHEA對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控機制。
　　方法在成骨培養(yǎng)條件下，分別將DHEA加入間充質(zhì)干細(xì)胞單培養(yǎng)，骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系，Treg與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系，骨髓單核細(xì)胞—間充質(zhì)干

13、細(xì)胞—Treg三者共培養(yǎng)體系中，PCR檢測成骨細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，Osterix，Osteocalcein表達(dá)及特征性分子collagen1，RANKL表達(dá);定量檢測ALP活性; Alizarin Red染色檢測骨礦化結(jié)節(jié)的形成。并分別給予IGF-1，PI3K抑制劑及mTOR途徑的阻斷劑觀察其對DHEA效應(yīng)的影響。在成脂培養(yǎng)條件下，分別將DHEA加入間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，PCR檢測脂肪細(xì)胞特征

14、性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ表達(dá)，Oil Red O染色計數(shù)脂肪細(xì)胞。小鼠去勢后灌服DHEA，microCT及骨組織化學(xué)染色法檢測DHEA對去勢小鼠骨形態(tài)的調(diào)控。流式細(xì)胞數(shù)檢測DHEA對鼠脾臟各淋巴細(xì)胞亞群（CD19+B細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD3e-panNK+細(xì)胞、FoxP3+Treg細(xì)胞）的調(diào)控。
　　結(jié)果 DHEA促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化;在骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，DHEA可下調(diào)骨髓單核細(xì)

15、胞對成骨細(xì)胞生成的抑制作用;在Treg與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，DHEA增強Treg對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用;在骨髓單核細(xì)胞—間充質(zhì)干細(xì)胞—Treg共培養(yǎng)體系中，DHEA也促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化;DHEA可促進(jìn)Runx2、Collagen1、Osteocalcin、OSX表達(dá)增強，下調(diào)RANKL表達(dá);并使生成的成骨細(xì)胞ALP活性增加;骨礦結(jié)節(jié)形成的數(shù)目顯著增多。IGF-1、PI3K抑制劑及mTOR途徑的阻斷不

16、影響DHEA效應(yīng)。在成脂環(huán)境中，不管是在間充質(zhì)干細(xì)胞單培養(yǎng)，還是骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，DHEA都促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化;PPARγ mRNA表達(dá)增加。在同樣間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目條件下，DHEA分別在成骨環(huán)境中或成脂環(huán)境中，促進(jìn)生成的成骨細(xì)胞數(shù)目和脂肪細(xì)胞數(shù)目的比值是增加的，因此DHEA的成骨作用占主導(dǎo)地位。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，DHEA顯著改善了骨形態(tài)。DHEA下調(diào)了去勢小鼠脾臟CD19+B細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞、

17、CD8+T細(xì)胞比率;DHEA不改變CD3e-panNK+細(xì)胞百分比;DHEA促進(jìn)了FoxP3+Treg百分比。
　　結(jié)論 DHEA可直接促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化;DHEA還可下調(diào)骨髓單核細(xì)胞對成骨細(xì)胞生成的抑制作用;DHEA增強Treg對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用;使Runx2、Collagen1、Osteocalcin、OSX表達(dá)增強，下調(diào)RANKL表達(dá);成骨細(xì)胞ALP活性增加;骨礦結(jié)節(jié)數(shù)目顯著增多。IGF-1并

18、不能加強DHEA的效應(yīng)，DHEA的作用途徑是非PI3K-mTOR依賴。雖然DHEA也可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，但DHEA的成骨作用占主導(dǎo)地位。DHEA顯著改善骨形態(tài);并促進(jìn)FoxP3+Treg百分比。DHEA可顯著改善骨免疫內(nèi)環(huán)境。因此，DHEA可能是一種較為理想的PMO防治方案。
　　第四部分 BSNXD促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的分子機制
　　目的觀察BSNXD對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控機制。

19、　　方法在成骨培養(yǎng)條件下，分別將BSNXD中藥血清和對照鼠血清加入間充質(zhì)干細(xì)胞單獨培養(yǎng)，骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系，Treg與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系，骨髓單核細(xì)胞—間充質(zhì)干細(xì)胞—Treg三者共培養(yǎng)體系中，PCR檢測成骨細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2，Osterix，Osteocalcein表達(dá)及特征性分子collagen1，RANKL表達(dá);定量檢測ALP活性; Alizarin Red染色檢測骨礦化結(jié)節(jié)的形成。并分別給予IGF

20、-1，PI3K抑制劑及mTOR途徑阻斷劑，觀察其對BSNXD中藥血清效應(yīng)的影響。在成脂培養(yǎng)環(huán)境下，分別將BSNXD中藥血清加入間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，PCR檢測脂肪細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子PPARγ表達(dá)，Oil Red O染色計數(shù)脂肪細(xì)胞。小鼠去勢后灌服BSNXD，microCT及骨組織化學(xué)染色法檢測BSNXD對去勢小鼠骨形態(tài)的調(diào)控。流式細(xì)胞數(shù)檢測BSNXD對鼠脾臟各淋巴細(xì)胞亞群（CD19+B細(xì)胞、CD14+單核

21、細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD3e-panNK+細(xì)胞、FoxP3+Treg細(xì)胞）的調(diào)控。
　　結(jié)果 BSNXD促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化;在骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，BSNXD可下調(diào)骨髓單核細(xì)胞對成骨細(xì)胞生成的抑制作用;在Treg與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，BSNXD增強Treg對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用;在骨髓單核細(xì)胞—間充質(zhì)干細(xì)胞—Treg共培養(yǎng)體系中，BSNXD也促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化;

22、BSNXD可促進(jìn)Runx2、Collagen1、Osteocalcin、OSX表達(dá)增強，下調(diào)RANKL表達(dá);并使生成的成骨細(xì)胞ALP活性增加;骨礦結(jié)節(jié)形成的數(shù)目顯著增多。IGF-1通過PI3K及mTOR信號途徑調(diào)控BSNXD效應(yīng)。在成脂環(huán)境中，不管是在間充質(zhì)干細(xì)胞單培養(yǎng)，還是骨髓單核細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，BSNXD都不影響間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化;PPARγ mRNA表達(dá)明顯無差異。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，BSNXD顯著改善了骨形

23、態(tài)。BSNXD下調(diào)了去勢小鼠脾臟CD19+B細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比率;BSNXD促進(jìn)了CTLA-4+Treg百分比。與DHEA相比，BSNXD增加骨骼BMD更顯著。
　　結(jié)論 BSNXD可直接促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化;BSNXD還可下調(diào)骨髓單核細(xì)胞對成骨細(xì)胞生成的抑制作用;BSNXD增強Treg對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用;使Runx2、Collagen1、Osteocalcin、OSX表達(dá)增強