Orai1調控成骨細胞分化與凋亡參與絕經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的機制研究.pdf

1、背景:
　　雌激素水平下降導致骨形成和骨吸收失衡是誘發(fā)絕經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的主要機制。絕經(jīng)后骨質疏松癥可引起骨的脆性增加和骨的強度降低,并最終導致容易發(fā)生骨折,嚴重影響中老年婦女的健康?；謴秃途S持骨形成與骨吸收的平衡是目前骨質疏松研究和治療的焦點。之前的研究主要集中在抑制破骨細胞活性以減少骨吸收,但近年來成骨細胞的分化或凋亡異常導致骨量減少越來越受到人們的重視。骨質疏松癥的研究方向已逐漸從單一抑制破骨細胞活性轉移至多向研究成骨

2、細胞與破骨細胞的功能及其調控機制,以重新平衡骨形成與骨吸收過程。成骨細胞的功能恢復和數(shù)目維持已成為目前骨質疏松癥治療的研究重點。因此,深入研究調控成骨細胞骨形成能力的分子機制,發(fā)現(xiàn)具有促成骨作用的藥物靶點,將會為絕經(jīng)后骨質疏松癥的治療提供新的策略和新的方法。Orai1是最近發(fā)現(xiàn)和鑒定的介導細胞受體依賴型鈣離子內流的鈣通道,是一個四次跨膜蛋白。研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Orai1基因后,小鼠出現(xiàn)體型減小、骨皮質變薄、松質骨減少等成骨不全癥狀,提示鈣

3、通道 Orai1的異?？赡軈⑴c骨形成過程。然而Orai1介導骨形成的具體分子機制尚未見報道。本研究從Orai1調控成骨細胞的分化與凋亡入手,深入探討Orai1調控骨形成的分子機制。該研究明確了Orai1在骨形成方面的作用及其機制,可為臨床骨質疏松癥的治療提供新的藥物靶點和新的策略。
　　目的:
　　闡明Orai1調控成骨細胞分化與凋亡參與絕經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的機制
　　方法:
　　1.通過去勢法構建小鼠絕經(jīng)后

4、骨質疏松癥模型,檢測成骨細胞 Orai1表達與鈣離子內流變化;通過構建Orai1穩(wěn)定knockdown細胞模型,檢測成骨關鍵指標ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix轉錄及ALP活性和鈣結節(jié)形成能力,并檢測鈣離子依賴的Ras-ERK1/2與CaMKII-NF-ATc信號通路活性,明確Orai1是否參與調控成骨細胞骨形成過程。
　　2.17β-E2刺激小鼠MC3T3-E1細胞,檢測Orai1蛋白表達與mRNA轉錄水平,并

5、檢測AKT-mTOR信號通路活性;應用特異性抑制劑抑制AKT與mTOR活性后,檢測17β-E2對Orai1蛋白表達與mRNA轉錄水平的影響,明確雌激素調控Orai1的機制。17β-E2誘導Orai1 knockdown細胞模型成骨,檢測成骨關鍵指標ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix轉錄及 ALP活性和鈣結節(jié)形成能力,并檢測鈣離子依賴的Ras與CaMKII信號通路活性,明確雌激素可否通過Orai1促進成骨細胞分化。

6、　　3.Tg誘導成骨細胞內質網(wǎng)應激后,檢測17β-E2對細胞凋亡、Caspase-12和Caspase-3的活性及內質網(wǎng)應激標志性分子Grp78與CHOP表達的影響,明確17β-E2可否抑制內質網(wǎng)應激誘導成骨細胞凋亡過程。內質網(wǎng)應激條件下檢測17β-E2對調控Grp78轉錄的關鍵轉錄因子ATF6、YY1、IRE1和TFII-I及Ras-ERK1/2信號通路影響,明確17β-E2抑制內質網(wǎng)應激誘導成骨細胞凋亡的分子機制。
　　4.B

7、MP2誘導Orai1 knockdown細胞模型成骨,檢測成骨關鍵指標ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix轉錄及 ALP活性和鈣結節(jié)形成能力,并檢測鈣離子依賴的Ras與CaMKII信號通路活性,明確BMP2可否通過Orai1促進骨形成。BMP2誘導細胞成骨分化后,檢測調控Orai1表達或活性的關鍵信號分子活性,并加入相應信號通路抑制劑,明確BMP2調控Orai1的分子機制。
　　結果:
　　1.我們應用去勢法構

8、建小鼠絕經(jīng)后骨質疏松癥模型并發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質疏松癥小鼠成骨細胞Orai1表達下降并且鈣離子內流減少。接著我們應用shRNA干擾技術在人MG63和鼠MC3T3-E1細胞中成功構建Orai1穩(wěn)定knockdown細胞模型,我們發(fā)現(xiàn)抑制Orai1的表達后,成骨關鍵指標ALP、OCN、OPN的轉錄以及ALP活性和鈣結節(jié)形成能力均下降,并且調控成骨細胞分化的特異性轉錄因子Runx2和Osterix轉錄以及鈣離子依賴的Ras-ERK1/2與CaMKI

9、I-NF-ATc信號通路活性也顯著抑制,提示Orai1通過促進鈣離子內流激活Ras-ERK1/2與CaMKII-NF-ATc信號通路促進成骨細胞骨形成過程。
　　2.我們用17β-E2刺激MC3T3-E1細胞發(fā)現(xiàn)Orai1蛋白表達與mRNA轉錄水平呈時間依賴性增加,并且發(fā)現(xiàn)17β-E2可明顯促進AKT與mTOR的活性增加。我們用特異性抑制劑抑制AKT與mTOR活性后,阻斷了17β-E2促進成骨細胞Orai1表達的作用,提示17β-

10、E2通過激活AKT-mTOR信號通路促進成骨細胞Orai1的表達。初步揭示了雌激素降低導致成骨細胞Orai1表達降低的分子機制。我們還發(fā)現(xiàn)抑制Orai1表達可明顯阻斷17β-E2促進成骨關鍵指標 ALP、OCN、OPN的轉錄以及促進 ALP活性和鈣結節(jié)形成能力的作用,并阻斷17β-E2促進成骨細胞分化的特異性轉錄因子Runx2和Osterix轉錄以及激活Ras與CaMKII信號通路的作用,提示17β-E2通過促進Orai1表達促進成骨細

11、胞成骨分化。
　　3.我們發(fā)現(xiàn)在內質網(wǎng)應激條件下17β-E2通過促進Grp78表達,抑制Caspase-12和Caspase-3的活性抑制內質網(wǎng)應激誘導的成骨細胞凋亡。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)17β-E2通過促進Orai1表達,激活Ras-ERK1/2信號通路,促進TFII-I的磷酸化并入核與Grp78啟動子區(qū)結合,促進Grp78表達。該研究揭示了Orai1參與調控成骨細胞凋亡的分子機制。
　　4.我們發(fā)現(xiàn)在BMP2促成骨誘導條件

12、下,下調Orai1表達可抑制成骨特異性轉錄因子Runx2和Osterix的轉錄,并進一步抑制成骨標志性分子ALP、OCN和OPN的轉錄,從而抑制了成骨細胞的成骨分化能力。我們還發(fā)現(xiàn)下調Orai1表達可抑制BMP2促進的鈣離子內流以及鈣離子依賴的Ras和CaMKII信號通路的激活,從而抑制成骨特異性轉錄因子Runx2和Osterix轉錄,以及成骨標志性分子ALP、OCN和OPN的轉錄。進一步研究發(fā)現(xiàn)BMP2通過激活Integrinβ1-F

13、AK-Src信號通路促進Orai1活化和鈣離子內流以及 Ras和CaMKII信號通路的激活,促進成骨細胞的分化和細胞外礦物鈣化過程。并且證實Integrinβ1與BMP2受體BMPR-I和BMPR-II在細胞膜上存在直接的相互作用。初步揭示了BMP2調控Orai1活性促進成骨細胞分化的分子機制。
　　結論:
　　綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后由于雌激素水平下降,AKT-mTOR信號通路活性降低導致Orai1表達下降。Orai1表達