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文檔簡介
1、本文以家蠶繭殼為實驗材料,采用多種蠶絲脫膠和絲素纖維溶解的方法,制成不同的絲素纖維、再生液態(tài)絲素及其絲素膜,詳細研究了蠶絲脫膠方法對絲素纖維結(jié)構(gòu)和機械性能的影響;蠶絲脫膠和纖維溶解方法對再生液態(tài)絲素的穩(wěn)定性、分子質(zhì)量大小以及再生絲素膜的分子結(jié)構(gòu)和特性的影響。此外,本文對電泳沉積技術(shù)進行改良,發(fā)明了一種新穎的水凝膠膜制備方法,在自制的電泳沉積裝置中將再生液體絲素加工成絲素水凝膠膜(FHM),系統(tǒng)研究了絲素溶液再生方法和電泳沉積條件等對水凝
2、膠膜的形成及其機械性能和結(jié)構(gòu)的影響,并通過體內(nèi)外實驗對這種新型水凝膠膜進行生物安全性評價。此外,本實驗還以蠶蛹殼制備的殼聚糖為材料,將上述電泳沉積法略加改變后又成功地制備出了另一種新穎的、光滑、柔軟而透明的蛹殼聚糖水凝膠膜(CHM),作者同樣對這種凝膠膜進行了機械性能、結(jié)構(gòu)及其生物安全性等相關(guān)方面的研究。
本文的研究主要涉及以下三個方面:
(1)本文以雌性蠶繭的繭殼為實驗材料,采用不同蠶絲脫膠和絲素纖維溶解的方法制成
3、了三種絲素纖維和四種類型的再生液態(tài)絲素及其絲素膜。三種脫膠方法處理對絲素纖維的影響經(jīng)熱分析和機械性能測試表明,使用常規(guī)的碳酸鈉溶液脫膠對絲素纖維的影響最大,導致熱分解溫度降低,比尿素脫膠纖維的下降近7?C,機械性能也顯著下降,纖維的斷裂應力、斷裂能以及伸長率都分別下降為尿素脫膠纖維的63%、38%和55%。強堿性電解水(pH≤11.50)中脫膠對纖維的影響次之,而尿素緩沖液中脫膠則最為溫和,獲得的纖維熱分解溫度最高,伸長率能達到45%。
4、SDS-PAGE電泳分析表明,80℃的尿素緩沖液脫膠和25℃的中性鹽溴化鋰溶液(9.3 M)中溶解可以獲得較完整的再生液態(tài)絲素,分子質(zhì)量≥200 kDa,而常規(guī)的碳酸鈉溶液煮沸脫膠會導致絲素纖維肽鏈的嚴重斷裂,由此產(chǎn)生的再生液態(tài)絲素平均分子質(zhì)量在85 kDa左右。同樣碳酸鈉脫膠處理獲得的絲素纖維無論是使用氯化鈣三元溶劑70℃溶解還是9.3 M溴化鋰溶劑25 ℃溶解,絲素肽鏈的斷裂程度差異并不明顯,這說明再生液體絲素肽鏈的斷裂主要是由碳酸
5、鈉溶液脫膠引起的。液體絲素穩(wěn)定性觀察表明,絲素肽鏈的斷裂程度與液態(tài)絲素保存的穩(wěn)定性成正相關(guān)。DSC熱分析結(jié)果證明,絲素膜經(jīng)甲醇浸漬后發(fā)生的β-折疊變化使膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度升高,熱分解溫度也略有升高,肽鏈越完整的絲素膜其熱分解溫度越高。X-射線衍射分析結(jié)果說明,經(jīng)甲醇處理的再生絲素膜的構(gòu)象具有更強的β化趨勢,結(jié)晶度也更高。上述試驗結(jié)果證明,再生絲素的分子結(jié)構(gòu)及其特性與其說是絲素纖維的溶解及其環(huán)境條件決定的,倒不如說是蠶絲的脫膠方法及其環(huán)境
6、條件決定的。
(2)再生液態(tài)絲素通常是指絲素纖維通過脫膠、溶解后獲得的可以制備成各種形態(tài)材料的絲素溶液。這種再生絲素溶液是一種處于亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)的蛋白,在酸、離子或者其他添加物存在下可以轉(zhuǎn)變成水凝膠。本實驗以尿素緩沖液脫膠和9.3 M溴化鋰溶劑25℃溶解獲得的再生液態(tài)絲素為實驗材料,采用一種新穎的方法在本實驗室自制的電泳沉積裝置中制備FHM。這種電泳沉積裝置由納米纖維膜以及陶瓷膜隔開,分為上、下兩個部分,上面為陰極室,下面為陽極室
7、。在電場作用下,上面陰極室中帶負電荷的絲素分子會向陽極室運動,并在運動過程中不斷變性,從而在攔截的納米屏障膜上形成絲素水凝膠膜。本文詳細研究了不同電泳條件對FHM表觀性能和機械性能的影響,應用紅外光譜、XRD、DSC等分析方法研究這種新型材料的結(jié)構(gòu)特性,并通過體內(nèi)外實驗分析了這種新型3D材料的生物學性能特征。實驗結(jié)果表明,在80 VDC直流電壓、pH6.55~7.55的Tris緩沖液條件下可以制備光滑、半透明、柔軟的水凝膠膜,膜的溶脹率
8、達到1054.7%。屏障膜在分子攔截量為10 kDa時獲得的凝膠膜的回收率最高能達到97.4%。光譜分析表明FHM主要是以α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)存在。掃描電鏡觀察反映出水凝膠膜是以直徑約為30 nm的球狀蛋白分子構(gòu)成,球狀絲素蛋白相互串聯(lián)、編織成多孔的3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。L-929小鼠成纖維細胞培養(yǎng)結(jié)果表明這種絲素水凝膠膜能滿足小鼠成纖維細胞的正常生長。初步的小鼠皮下移植實驗結(jié)果也表明,F(xiàn)HM作為移植體在術(shù)后初期會造成輕微炎癥反應,但這種炎癥
9、組織浸潤的情況在術(shù)后4周會逐漸減緩,到第6周幾乎消失。和對照的假手術(shù)組相比,F(xiàn)HM移植組的小鼠血清中TNF-α和IL-6水平并無顯著性差異,這表明FHM有可能成為一種體內(nèi)填充的新型3D醫(yī)用組織工程生物材料。
(3)蠶蛹殼中含有33%~44%的甲殼素,可用來生產(chǎn)甲殼素并通過脫乙酰制備殼聚糖。本文以家蠶制種的廢棄物—蠶蛹殼為材料,通過脫脂、脫蛋白、脫鹽、脫色以及脫乙酰等一系列步驟制備蛹殼聚糖,并將上述改良的電泳沉積方法擴展運用蛹殼
10、聚糖上來制備蠶蛹殼聚糖水凝膠膜(CHM)。原裝置稍作修改后,內(nèi)室改為陽極室,外室則相應變?yōu)殛帢O室。在電場作用下,加入到上面陽極室中的帶正電荷的殼聚糖分子會不斷向陰極室運動,并在攔截的納米屏障膜上形成CHM。接著,本文還研究了不同電泳條件對于CHM的表觀和機械性能的影響,應用光譜分析等方法研究這種新型3D材料的結(jié)構(gòu)特性,并通過體內(nèi)和體外實驗探索了這種新型材料的生物學性能特征。優(yōu)化試驗結(jié)果表明,在60 VDC的直流電壓和pH8.5的Tris
11、緩沖液條件下可以獲得光滑、透明、柔軟的殼聚糖水凝膠膜。這種水凝膠膜的回收率在通電1小時后能達到81.8%。機械性能測試表明,這種新型水凝膠膜具有良好的機械性能,斷裂伸長率高達42.5%。光譜分析表明,CHM主要是以I型和II型結(jié)晶結(jié)構(gòu)同時存在。體外溶血試驗表明,這種新型材料具有良好的生物相容性,不會破壞紅細胞。L-929小鼠成纖維細胞培養(yǎng)結(jié)果也顯示,這種殼聚糖水凝膠膜能滿足細胞的正常生長,且在一定程度上還能促進細胞的生長。小鼠皮下移植實
12、驗的初步結(jié)果表明,CHM作為移植體在術(shù)后初期會造成輕微炎癥反應,但在第三周CHM移植組的炎癥細胞數(shù)量以及TGF-β1陽性表達量能降到正常水平。和假手術(shù)組相比,CHM移植組的小鼠皮膚組織中TNF-α和NF-κB含量水平并無顯著性差異。小鼠體內(nèi)實驗說明CHM不會引起嚴重的炎癥反應,有望成為一種人工皮膚、體內(nèi)移植或者裝載細胞的3D醫(yī)用組織工程材料。
綜上所述,本文詳細研究了蠶絲脫膠和纖維溶解方法對絲素分子結(jié)構(gòu)和特性的影響,在此基礎(chǔ)之
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