長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌中的表達及其對肺腺癌A549細胞惡性生物學表型和化療耐藥性的影響.pdf

1、目的:腫瘤特別是惡性腫瘤是世界范圍內人類死亡的主要原因之一，嚴重危害了人類的健康。近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，對人類健康的危害日漸嚴重。肺癌是最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國乃至全球范圍是發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，其中肺腺癌占40％以上。肺腺癌患者多數(shù)在初診時即已是晚期并發(fā)生轉移，預后不佳。目前肺腺癌主要的治療策略仍是手術切除和術后放射及化學藥物治療。盡管近年來的治療手段日益發(fā)展，但肺腺癌的5年生存率仍不能令人滿意

2、。因此，深入研究肺腺癌的病因學及新的治療手段尤為迫切。
　　手術治療是目前肺腺癌的首選治療手段，圍手術期的化療亦是肺腺癌的重要治療手段，是手術治療的有效補充。但是在臨床上，近70％的肺癌患者在就診時就已經處于局部晚期或者發(fā)生遠處轉移，在此種情況下，化療和放療成為大多數(shù)患者首選的治療方案。然而在化療過程中產生的化療耐藥降低了化療的效果，限制了化療的臨床應用。因此，加強對肺癌特別是肺腺癌化療耐藥分子機制的研究顯得尤為迫切。
　　

3、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個堿基的非編碼RNA，是近期分子生物學研究的熱點，其在腫瘤病因學的研究也日益受到重視，相關報道日益增多，對長鏈非編碼RNA的功能及分子機制的研究逐漸深入。長鏈非編碼RNA可以在表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等多種層面上調控下游的功能基因的表達水平，能夠參與細胞增殖、細胞周期、細胞分化、細胞凋亡以及細胞自噬性死亡等的調節(jié)，進而發(fā)揮其生物學作用。已

4、有研究表明在腫瘤細胞中，某些特定的長鏈非編碼RNA的表達水平會發(fā)生明顯改變，提示特定的長鏈非編碼RNA可能與該腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。腫瘤中差異表達長鏈非編碼RNA已經為腫瘤的診斷和治療提供了新的方向。隨著研究不斷深入，長鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生進展中的作用以及調控基因的方式等的研究成果將為腫瘤的臨床診斷和預后標志物的研究以及研發(fā)新的以長鏈非編碼RNA為治療靶點的治療手段解開新的篇章。
　　同時越來越多的研究還證實長鏈非編碼RNA

5、參與了眾多腫瘤的化療耐藥過程，其中包括肺腺癌。例如，長鏈非編碼RNA-HOTAIR能夠通過沉默p21蛋白誘導肺腺癌細胞對紫杉醇的耐藥性。H19敲除能夠降低肺腺癌細胞對順鉑的反應性，高表達H19的肺腺癌患者的預后更差，順鉑化療的效果不佳。
　　長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1 Opposite Strand/AntisenseTranscript1，KCNQ1OT1)定位11p15.5，近期研究發(fā)現(xiàn)其在結直腸癌中

6、存在表達及功能異常。而其在肺腺癌中的功能和分子機制及其與化療耐藥的關系迄今無深入的研究。在前期工作中，我們應用長鏈非編碼RNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌中存在顯著的高表達，提示KCNQ1OT1可能參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展?；趯﹂L鏈非編碼RNA芯片結果的深入分析還發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1與MDR1基因存在顯著的正相關，而MDR1參與化療耐藥的形成已被學者明確證實，提示KCNQ1OT1可能與肺腺癌的化療耐藥相關。因此

7、我們開展如下深入的研究。
　　本研究擬檢測長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌組織及細胞系中的表達，并研究KCNQ1OT1對肺腺癌A549細胞增殖、細胞周期、凋亡和侵襲等細胞生物學表型的調節(jié)作用，以及其對肺腺癌紫杉醇耐藥細胞A549/PA細胞化療耐藥性的調節(jié)作用。
　　研究方法:
　　1、TRIZOL法提取76例手術切除的肺腺癌組織及相應的癌旁組織的總RNA。實時定量PCR(qRT-PCR)檢測其中KCNQ1OT

8、1的表達。
　　2、統(tǒng)計學分析明確KCNQ1OT1表達與肺腺癌患者的瘤體大小、分化程度、TNM分期以及淋巴結轉移等臨床病理信息的相關性。
　　3、實時定量PCR檢測正常支氣管上皮16HBE細胞與肺腺癌A549細胞中KCNQ1OT1的表達。
　　4、應用RNA干擾技術沉默A549細胞中KCNQ1OT1的表達，實時定量PCR驗證沉默效果。
　　5、MTT法檢測KCNQ1OT1沉默對A549細胞增殖能力的調節(jié)作用。

9、r>　　6、PI單標流式細胞法檢測KCNQ1OT1沉默對A549細胞細胞周期的調節(jié)作用。
　　7、雙標流式細胞法檢測KCNQ1OT1沉默對A549細胞凋亡的調節(jié)作用。
　　8、Transwell法檢測KCNQ1OT1沉默對A549細胞的侵襲能力的調節(jié)作用。
　　9、選取應用紫杉醇方案化療的41例肺腺癌患者，參照RECIST療效評價標準將其分為化療敏感組（16例）和化療非敏感組（25例），實時定量PCR檢測兩組中KCNQ

10、1OT1的表達。
　　10、獲取對紫杉醇耐藥的A549/PA細胞，檢測A549/PA細胞對紫杉醇的半抑制濃度(IC50)，明確其對紫杉醇的耐藥性。
　　11、實時定量PCR檢測A549細胞及A549/PA細胞中KCNQ1OT1的表達。
　　12、應用RNA干擾技術沉默A549/PA細胞中KCNQ1OT1的表達，實時定量PCR驗證沉默效果。
　　13、 MTT法檢測KCNQ1OT1沉默的A549/PA細胞對紫杉醇的

11、半抑制濃度。
　　14、Western Blot法檢測KCNQ1OT1沉默的A549/PA細胞中多藥耐受蛋白1(MDR1)的表達。
　　結果:
　　1、芯片篩查肺腺癌中表達異常的長鏈非編碼RNA
　　長鏈非編碼RNA芯片篩查顯示，長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌組織中的表達顯著上調。
　　2、肺腺癌組織及A549細胞中KCNQ1OT1的表達
　　實時定量PCR檢測76例手術切除的肺腺癌組織及

12、A549細胞中的KCNQ1OT1表達。結果顯示，與癌旁正常組織相比，肺腺癌組織中KCNQ1OT1表達明顯增加;與對照的16HBE細胞相比，A549細胞中KCNQ1OT1表達顯著增加。
　　3、 KCNQ1OT1表達與肺腺癌患者臨床病理信息的相關分析
　　KCNQ1OT1的表達與肺腺癌的分化程度及病理分期相關。隨著腫瘤體積的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴結轉移的出現(xiàn)，肺腺癌中KCNQ1OT1的表達明顯增高。

13、r>　　4、 KCNQ1OT1表達沉默對A549細胞惡性表型的調節(jié)作用
　　實時定量PCR檢測結果顯示轉染si-KCNQ1OT1能夠顯著抑制A549細胞中KCNQ1OT1的表達。KCNQ1OT1沉默能夠顯著抑制A549細胞的增殖活力和侵襲能力，阻滯A549細胞于G0/G1期，并誘導A549細胞發(fā)生凋亡。KCNQ1OT1沉默能夠顯著地抑制A549細胞的惡性生物學表型。
　　5、 KCNQ1OT1在紫杉醇化療敏感肺腺癌組織及紫杉

14、化療非醇敏感肺腺癌組織中的表達
　　實時定量PCR檢測結果顯示，與化療敏感組相比，化療非敏感組肺腺癌組織中KCNQ1OT1表達顯著增加。
　　6、紫杉醇耐藥細胞系A549/PA的驗證
　　對獲得耐紫杉醇細胞系A549/PA進行檢驗，結果顯示A549/PA細胞對紫杉醇的耐受性大幅度提高，存活率增加。
　　7、 KCNQ1OT1在A549細胞及A549/PA細胞中的表達
　　實時定量PCR檢測A549細胞及A5

15、49/PA細胞中KCNQ1OT1的表達。結果顯示，與A549細胞相比，A549/PA細胞中KCNQ1OT1表達顯著增加。
　　8、 KCNQ1OT1表達沉默對A549/PA細胞的紫杉醇化療耐藥性的調節(jié)作用
　　實時定量PCR檢測結果顯示轉染si-KCNQ1OT1能夠顯著抑制A549/PA細胞中KCNQ1OT1的表達。KCNQ1OT1沉默能夠顯著降低A549/PA細胞對紫杉醇的IC50值，抑制A549/PA細胞對紫杉醇的耐藥性

16、，并顯著降低MDR1蛋白在A549/PA細胞中的表達。
　　討論:
　　我們前期的長鏈非編碼RNA芯片篩查中發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在5例肺腺癌組織中表達顯著上調。然后，我們應用實時定量PCR檢測了76例肺腺癌組織，大樣本組織表達檢測證實了KCNQ1OT1在肺腺癌中確實存在顯著的表達上調。這與李靜等在非小細胞肺癌中的研究結果相符，他們發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1在89例非小細胞肺癌中的表達水平明顯增高。這初步證實KCNQ1OT1的表達

17、異?？赡芘c肺腺癌的發(fā)生發(fā)展相關。
　　為了進一步明確KCNQ1OT1與肺腺癌的相關性，我們運用統(tǒng)計學方法分析了KCNQ1OT1表達與肺腺癌患者的臨床病理信息的相關性。統(tǒng)計分析結果顯示，KCNQ1OT1的表達與多種肺腺癌的臨床病理信息相關，隨著肺腺癌腫瘤體積的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴結轉移的出現(xiàn)，肺腺癌中KCNQ1OT1的表達明顯增高。這進一步提示KCNQ1OT1與肺腺癌密切相關，可能在肺腺癌的進展和侵襲轉移中

18、發(fā)揮作用。
　　KCNQ1OT1在肺腺癌中的功能尚不清楚，亦無相關文獻報道。為此，我們應用RNA干擾技術沉默了肺腺癌A549細胞中的KCNQ1OT1表達，并檢測其表達沉默對A549細胞的增殖、細胞凋亡及侵襲能力的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1沉默能夠顯著抑制A549細胞的增殖活力和侵襲能力，阻滯A549細胞于G0/G1期，并誘導A549細胞發(fā)生凋亡。KCNQ1OT1沉默能夠顯著地抑制A549細胞的惡性生物學表型，在肺腺癌中發(fā)

19、揮腫瘤促進作用，可能成為肺腺癌潛在的癌基因。
　　化療能夠在一定程度上抑制肺腺癌的復發(fā)和轉移，改善患者的預后。然而在化療過程中產生的化療耐藥降低了化療的效果，限制了化療的臨床應用。我們對KCNQ1OT1在肺腺癌組織中的表達情況進行深入的分析發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在對紫杉醇化療不敏感的肺腺癌患者的瘤體組織中的表達顯著上調，提示KCNQ1OT1可能參與肺腺癌的化療耐藥的發(fā)生。而且， KCNQ1OT1在對紫杉醇耐藥的肺腺癌A549/PA

20、細胞中的表達較其在A549細胞中的表達顯著增高，進一步證實其表達異常可能與肺腺癌的化療耐藥相關。然后，我們沉默了A549/PA細胞中KCNQ1OT1的表達，發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1沉默能夠顯著降低A549/PA細胞對紫杉醇的IC50值，抑制A549/PA細胞對紫杉醇的耐藥性。我們認為KCNQ1OT1參與了肺腺癌細胞化療耐藥的形成，沉默其表達能夠顯著抑制肺腺癌耐藥細胞對紫杉醇的耐藥性，KCNQ1OT1可能會成為肺腺癌新的治療靶點。
　　

21、Gene Ontology(GO)分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析的結果顯示KCNQ1OT1與MDR1基因存在顯著的正相關。MDR1基因是目前已經明確的腫瘤化療耐藥相關基因，其編碼的蛋白是位于細胞上的重要的ATP依賴的流出泵，其能夠將化療藥物在其到達細胞質之前泵出細胞，阻止化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用。KCNQ1OT1沉默能夠顯著降低MDR1蛋白在A549/PA細胞中的表達。

22、因此，我們推測KCNQ1OT1能夠通過正性調節(jié)MDR1基因的表達，參與肺腺癌紫杉醇耐藥的形成。
　　上述研究結果說明KCNQ1OT1能夠通過調節(jié)MDR1基因的表達，參與肺腺癌紫杉醇耐藥的形成，可能是肺腺癌潛在的癌基因。上述研究成果為研究肺腺癌化療耐藥發(fā)生的分子機制提供了新的實驗依據(jù)，進一步的研究將為明確肺腺癌的臨床治療提供新的靶點。
　　結論:
　　1.長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌中表達顯著上調，且與肺腺