長鏈非編碼RNA GAS5逆轉(zhuǎn)肺腺癌對吉非替尼耐藥的研究.pdf

1、前言:
　　肺癌是臨床中最常見的惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的15％。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的85％，肺腺癌又是非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型之一，預(yù)后較差。盡管肺癌的診斷和治療已經(jīng)有了長足的進(jìn)步，但進(jìn)展期的肺癌預(yù)后仍然較差，許多病例在診斷時已經(jīng)處于疾病的晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，而傳統(tǒng)放、化療的治療效果已不明顯。非小細(xì)胞肺癌的患者5年生存率僅為5％～10％。
　　吉非替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGF

2、R-TKI)，常用于非小細(xì)胞肺癌治療，其機(jī)制為通過與ATP或底物競爭性結(jié)合胞外的配體結(jié)合位點(diǎn)，阻斷EGFR分子內(nèi)酪氨酸的自身磷酸化和酪氨酸激酶的活化，抑制EGFR激活，阻止下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制有絲分裂原活化蛋白激酶的活化，抑制腫瘤血管生成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該藥物在臨床實(shí)踐中取得了顯著療效，然而臨床上有部分患者對EGFR-TKI治療不敏感，或經(jīng)過一段時間對吉非替尼最終產(chǎn)生耐藥。NSCLC病人酪氨酸激酶區(qū)域的EGFR發(fā)生，其中19號外顯子的框架

3、缺失和21號外顯子上的點(diǎn)突變?yōu)槊舾行酝蛔?。而耐藥突變的機(jī)制主要包括原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥，前者包括EGFR耐藥突變、KRAS突變、PTEN表達(dá)缺失和上皮間質(zhì)型轉(zhuǎn)化;繼發(fā)耐藥機(jī)制主要包括T790M突變、VEGF/VEGFR表達(dá)變異、MET基因擴(kuò)增HGF超表達(dá)和IGF-1R的過表達(dá)。原發(fā)和繼發(fā)耐藥機(jī)制并不是相互獨(dú)立的，而是有相互交叉作用。因而，研究如何增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對吉非替尼的敏感性具有重要的臨床意義。
　　長鏈非編碼RNA(LncRNA)

4、是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，LncRNA在各種疾病中的作用越來越突出，已成為繼MicroRNA之后又一研究熱點(diǎn)。有研究表明LncRNA能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力、運(yùn)動性和侵襲力，并和耐藥相關(guān)。GAS5最初作為生長停滯細(xì)胞中高表達(dá)的基因被發(fā)現(xiàn)。受mTOR蛋白調(diào)控并且表達(dá)受營養(yǎng)環(huán)境影響。GAS5由于與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)構(gòu)類似，可以通過競爭性抑制糖皮質(zhì)激素受體與其作用位點(diǎn)的結(jié)合抑制糖皮質(zhì)激素的作用。GAS5在乳腺癌及非小細(xì)胞

5、肺癌中低表達(dá)，并能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。且研究表明GAS5能夠影響細(xì)胞內(nèi)EGFR和Mir-21的表達(dá)水平，而Mir-21能夠調(diào)節(jié)IGF-1R的水平。IGF-1R的過表達(dá)又是肺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs耐藥的重要機(jī)制之一，因此我們猜測GAS5可能通過影響Mir-21來降低細(xì)胞內(nèi)IGF-1R的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)肺腺癌對EGFR-TKIs的耐藥。
　　目前，關(guān)于GAS5與肺癌耐藥的關(guān)系研究較少。因此，本研究旨在探討在人肺腺癌組織中GAS5的表

6、達(dá)情況，并研究其在肺腺癌中與吉非替尼耐藥的關(guān)系。
　　方法:
　　1、GAS5在人肺腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測GAS5在人肺腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。應(yīng)用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測GAS5在肺腺癌細(xì)胞系和支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2、GAS5聯(lián)合吉非替尼影響肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖作用，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將GAS5載體及空載體轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞。利用實(shí)時定量PCR方法檢測A549細(xì)胞中G

7、AS5的表達(dá)檢測是否轉(zhuǎn)染成功。MTT、平板克隆形成試驗(yàn)及EdU法檢測GAS5聯(lián)合吉非替尼對A549細(xì)胞增殖的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測GAS5聯(lián)合吉非替尼對A549細(xì)胞凋亡作用的影響。通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測GAS5聯(lián)合吉非替尼對A549細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的影響。
　　3、GAS5聯(lián)合吉非替尼抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖的機(jī)制。利用Western blot檢測GAS5聯(lián)合吉非替尼對EGFR及其下游通路蛋白的影響。利用Western blot檢

8、測GAS5聯(lián)合吉非替尼對IGF-1R的影響。
　　結(jié)果:
　　1、GAS5在肺腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示GAS5在肺腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，相對表達(dá)量為癌旁組織的0.76(P＜0.05)，且與腫瘤大小、分化程度和臨床分期相關(guān)(P＜0.05)。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示GAS5在四種肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)低于支氣管上皮細(xì)胞(P＜0.05)，四種肺癌細(xì)胞系，按GAS5的表達(dá)水平排序?yàn)镠CC827＞H1299＞

9、H1975＞A549。
　　2、GAS5聯(lián)合吉非替尼抑制肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖作用。轉(zhuǎn)染的載體由吉凱公司合成，經(jīng)過實(shí)時定量PCR檢測經(jīng)過轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞中GAS5的表達(dá)量相對與空載體為68倍(P＜0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。MTT法檢測顯示給藥濃度0.1、1、10、20和40μM/L吉非替尼聯(lián)合GAS5能夠顯著抑制A549細(xì)胞的生長(P＜0.05)。平板克隆形成試驗(yàn)表明GAS5聯(lián)合吉非替尼組克隆形成集落最少，對照組和吉非替尼組最

10、多(P＜0.05)。EdU實(shí)驗(yàn)表明GAS5聯(lián)合吉非替尼組DNA合成明顯受到抑制，合成率顯著低于其余三組(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測顯示GAS5聯(lián)合吉非替尼顯著促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，高于其余三組(P＜0.05)。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明，皮下注射30天后，GAS5聯(lián)合吉非替尼能夠顯著抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤形成，無論是體積還是重量，均低于其余三組(P＜0，05)。
　　3、GAS5增強(qiáng)吉非替尼作用的機(jī)制。Western Blot結(jié)果示:GA

11、S5聯(lián)合吉非替尼組在濃度為1、5、10μMol/l時EGFR、Akt及ERK的磷酸化水平明顯下降，并呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05);相反，在其余三組內(nèi)，EGFR、Akt及ERK的磷酸化水平下降不明顯。Western Blot結(jié)果顯示:GAS5聯(lián)合吉非替尼組中IGF-1R磷酸化水平明顯下降，呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05);其余三組下降不明顯。
　　結(jié)論:
　　1、肺腺癌組織中GAS5表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，并且與腫瘤大小、分