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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)在燒傷科是最常見的一種致病菌,它因具有特殊的耐藥機(jī)制,使得β-內(nèi)酰胺類藥物及其抑制劑復(fù)合物失效。此外,MRSA感染具有快速的傳播性和強(qiáng)烈的致病性,并可導(dǎo)致膿毒血癥、感染性休克等嚴(yán)重的并發(fā)癥,給醫(yī)院和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床應(yīng)用的主流MRSA檢測(cè)方法是基于耐藥表型的檢測(cè)方法,但這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn),不利于減少抗生素濫用現(xiàn)象;而基于耐藥基因的新型檢測(cè)方法存在價(jià)格昂貴、對(duì)
2、技術(shù)人員要求高等缺點(diǎn),限制了該技術(shù)的推廣。所以建立一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)MRSA新方法,對(duì)于控制感染和制定合理治療方案具有重大意義。
近紅外光譜分析技術(shù)是目前發(fā)展最快,最引人注目的一種分析技術(shù)。它以量子力學(xué)為基礎(chǔ),反映有機(jī)化合物分子振動(dòng)倍頻吸收和合頻吸收。因此可以通過(guò)分析近紅外光譜來(lái)獲得樣品中含氫基團(tuán)的特征信息。該技術(shù)分析樣品時(shí)具有快速、方便、準(zhǔn)確和成本較低,不破壞樣品,不消耗化學(xué)試劑,不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn),非常契合
3、我們所希望的耐藥菌檢測(cè)新方法的要求。光譜數(shù)據(jù)分析時(shí)會(huì)引入一些多元化學(xué)計(jì)量學(xué)算法用于數(shù)據(jù)處理和建模。
因此,本課題探索應(yīng)用近紅外光譜(NIRS)分析技術(shù)結(jié)合支持向量機(jī)(SVM)算法鑒別耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感金葡菌(MSSA),以期建立一種新的檢測(cè)耐藥菌的新方法。
方法:
1.將標(biāo)準(zhǔn)株MRSA(ATCC43300)和MSSA(ATCC25923)活化、分離、純化,挑取單菌落接種于盛有
4、5ml LB肉湯的試管中,在恒溫振蕩箱中擴(kuò)增18h,制備種子液。取200ul種子液加入盛有5ml LB肉湯試管中擴(kuò)增,在0-24h內(nèi),每隔兩小時(shí)記錄擴(kuò)增菌液的光密度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo),光密度值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線并確定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
2.將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液稀釋成不同濃度梯度,并測(cè)出其光密度值。將稀釋后的菌液10倍倍比稀釋7次,采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算出原有菌液濃度,建立實(shí)際濃度與光密度值之間關(guān)系曲線。
3.對(duì)研究對(duì)象進(jìn)
5、行科學(xué)分組,具體分為MRSA和MSSA兩大組,每組24個(gè)細(xì)菌樣本,共計(jì)48個(gè)。每個(gè)細(xì)菌樣本均擴(kuò)增至對(duì)數(shù)期和配成濃度為1×109cfu/ml的標(biāo)準(zhǔn)菌液。
4.連接光源、近紅外光譜儀、光纖探頭和計(jì)算機(jī),打開光譜采集軟件Spectrasuite,調(diào)試信號(hào)和設(shè)定參數(shù),待光譜儀狀態(tài)穩(wěn)定后,采集菌液樣本光譜信號(hào),每個(gè)菌液樣本按順時(shí)針?lè)较虿杉?0次,一共獲得960個(gè)光譜樣本。
5.將Spectrasuite軟件中光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出,以波
6、長(zhǎng)為X軸,反射率為Y軸,分別制作MRSA和MSSA的原始光譜圖,使用鑒別指數(shù)D值定量描述光譜數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性,并初步觀察分析MRSA和MSSA的差異。
6.對(duì)兩種細(xì)菌原始光譜曲線取平均值,并進(jìn)行平滑去噪、基線校正、一階求導(dǎo)和尋峰等預(yù)處理,力求使光譜間的差異變得更加顯著。對(duì)吸收峰進(jìn)行譜帶歸屬分析和相關(guān)系數(shù)分析,進(jìn)一步分析MRSA和MSSA的差異及其含義。
7.將原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析,壓縮變量后進(jìn)行聚類分布投影,觀察分
7、類情況。再將壓縮后的主成分得分向量作為支持向量機(jī)輸入向量建立MRSA和MSSA的鑒別模型。以2/3樣本作為訓(xùn)練集,余下1/3樣本作為預(yù)測(cè)集,計(jì)算線性、多項(xiàng)式、徑向基三種核函數(shù)下模型分類和預(yù)測(cè)的正確率。建模前需確定徑向基核函數(shù)和多項(xiàng)式核函數(shù)的最佳核參數(shù)。
8.對(duì)臨床分離菌株使用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行耐藥性鑒定,并以鑒定結(jié)果作為參照。按前期探索構(gòu)建的MRSA和MSSA鑒別模型方法,使用近紅外光譜法檢測(cè)。
9.以紙片擴(kuò)散法檢測(cè)結(jié)果
8、作為參照,對(duì)近紅外光譜檢測(cè)法準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià),同時(shí)參考文獻(xiàn)報(bào)道從分類準(zhǔn)確率、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)、操作步驟和價(jià)格等方面與其他主流檢測(cè)方法進(jìn)行比較。
結(jié)果:
1.通過(guò)分析MRSA和MSSA的生長(zhǎng)曲線,我們認(rèn)為在8-14h,細(xì)菌光密度值增高較快,對(duì)應(yīng)細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。兩種細(xì)菌的曲線變化趨勢(shì)相似,選擇對(duì)數(shù)期14h作為待測(cè)細(xì)菌擴(kuò)增的時(shí)間。
2.根據(jù)對(duì)數(shù)期細(xì)菌光密度值和實(shí)際菌液濃度的關(guān)系,得到MSSA的濃度曲線公式為y=4.841
9、x-0.053R2=0.9931;MRSA的濃度曲線公式為y=5.466x-0.049R2=0.9924。(單位為109cfu/ml),并設(shè)定1×109cfu/ml為實(shí)驗(yàn)菌株檢測(cè)濃度。
3.MRSA和MSSA組內(nèi)光譜曲線重現(xiàn)性考察,得到鑒別指數(shù)Dy1y2結(jié)果,MRSA的Dy1y2范圍為0-2,均值為0;MSSA的Dy1y2范圍為0-1,均值為0。實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好,儀器分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。
4.光譜預(yù)處理后,發(fā)現(xiàn)在950.1
10、nm、1140.92nm、1330.63nm、1383.89nm、1494.81nm、1748.28nm、1857.1nm、1927.59nm、2021.16nm處有吸收峰,MRSA和MSSA的波峰位置、波形、峰值未見明顯差異。
5.對(duì)MRSA和MSSA近紅外全波段原始數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析后,發(fā)現(xiàn)前三主成分占有光譜總變異性百分比分別為81.482%、6.247%、3.077%,累計(jì)貢獻(xiàn)率超過(guò)90%。以這三個(gè)主成分PC1、PC2、
11、PC3作為聚類依據(jù),繪制主成分聚類三維分布圖,可顯示較好區(qū)分效果。
6.在支持向量機(jī)建模前,使用訓(xùn)練集驗(yàn)證最佳核參數(shù),結(jié)果為多項(xiàng)式核參數(shù)為8,徑向基核參數(shù)為1.1。訓(xùn)練集分類正確率結(jié)果為,線性核函數(shù):96.02%±0.50%;多項(xiàng)式核函數(shù):98.73%±0.31%;徑向基核函數(shù):99.72%±0.21%。測(cè)試集預(yù)測(cè)正確率結(jié)果為,線性核函數(shù):95.69%±0.01%;多項(xiàng)式核函數(shù):98.88%±0.00%;徑向基核函數(shù):99.4
12、7%±0.00%,初步反映了近紅外光譜結(jié)合支持向量機(jī)算法所建立的MRSA標(biāo)準(zhǔn)株鑒別模型具有較高的分類準(zhǔn)確率。
7.近紅外光譜結(jié)合支持向量機(jī)算法建立的MRSA和MSSA鑒別模型檢測(cè)臨床分離金葡菌時(shí),訓(xùn)練集樣本分類正確率為98.03%,測(cè)試集樣本分類正確率為98.5%,進(jìn)一步說(shuō)明近紅外光譜分析技術(shù)在區(qū)分MRSA臨床株上具有較高的準(zhǔn)確率。
8.以紙片擴(kuò)散法鑒定結(jié)果為參照,近紅外法檢測(cè)MRSA的一致百分率為98.5%,靈敏度
13、為97.00%,特異度為100.00%。使用Pearsonx2檢驗(yàn),列聯(lián)系數(shù)ψ=0.971,Kappa值0.970,說(shuō)明近紅外光譜法與紙片擴(kuò)散法具有強(qiáng)烈的正相關(guān)且結(jié)果有極強(qiáng)的一致性。
9.對(duì)MRSA的檢測(cè)方法的比較,在準(zhǔn)確性上,近紅外法98.5%,結(jié)果高于文獻(xiàn)中報(bào)道的MIC肉湯稀釋法(91%)、耐藥蛋白檢測(cè)法(97.6%);在檢測(cè)耗時(shí)上,近紅外法耗時(shí)14h,低于紙片擴(kuò)散法(24-48h)、MIC肉湯稀釋法(24-36h)、瓊脂
14、稀釋法(24h);在操作步驟上,近紅外法簡(jiǎn)單,技術(shù)人員只需簡(jiǎn)單培訓(xùn)便可獨(dú)自完成;在價(jià)格上,近紅外法每次只需耗費(fèi)10-20元耗材,低于紙片擴(kuò)散法(80元/次)和肉湯稀釋法(250元/次),更遠(yuǎn)低于PCR法和PBP2a法。
結(jié)論:
利用近紅外光譜結(jié)合支持向量機(jī)算法構(gòu)建MRSA和MSSA鑒別模型是具有高度的準(zhǔn)確性和可行性。在檢測(cè)準(zhǔn)確性、檢測(cè)耗時(shí)、操作步驟、耗材價(jià)格等方面與紙片擴(kuò)散法、最小抑菌濃度法、PCR法、耐藥蛋白檢測(cè)法
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