2個(gè)新的鴿β-防御素5的克隆與生物學(xué)特性的初步研究.pdf

1、隨著抗生素濫用所產(chǎn)生的負(fù)面影響日益增多，抗菌肽作為一種新型抗菌制劑漸漸引起了人們的關(guān)注，其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)所發(fā)揮出的優(yōu)勢和獨(dú)特的抗菌機(jī)制也成為了科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。防御素是抗菌肽家族中的一員，具有高效廣譜的殺菌能力，而且它的抗菌機(jī)制使病原菌不易產(chǎn)生耐藥性，無論在先天性免疫還是獲得性免疫中都起到重要作用，有著極大的開發(fā)潛力作為飼料添加劑應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。
　　 從上一世紀(jì)八十年代開始，有關(guān)雞、鴨、鵝、火雞和企鵝等禽β-防御素的研究已經(jīng)取得

2、了突破性進(jìn)展，但有關(guān)鴿β-防御素到目前為止還罕有報(bào)道。為進(jìn)一步研究新的禽β-防御素，本試驗(yàn)采用RT-PCR方法，從鴿的骨髓和肝臟組織中擴(kuò)增到2個(gè)新的禽β-防御素(AvBD)基因。將測序結(jié)果與目前已知的禽β-防御素(AvBD)和部分哺乳類動物β-防御素的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析并繪制分子遺傳進(jìn)化樹。測序結(jié)果得到這2個(gè)基因的cDNA大小均為201 bp，編碼66個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)含6個(gè)位置保守的半胱氨酸。經(jīng)遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該基因推導(dǎo)的兩組氨

3、基酸序列與鴨AvBD5的同源性最高，分別為87.9％（骨髓）和78.8％（肝臟），兩組氨基酸序列之間的同源性為83.3％。因此，將其分別命名為鴿AvBD5α（骨髓）和鴿AvBD5β（肝臟）。
　　 另外，這兩個(gè)基因與哺乳動物β-防御素的同源性較低。進(jìn)一步將這兩個(gè)基因分別亞克隆到大腸桿菌pGEX-6p-1載體中進(jìn)行原核表達(dá)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，兩個(gè)重組融合蛋白和標(biāo)簽蛋白GST進(jìn)行純化后，以4種革蘭氏陽性菌和

4、8種革蘭氏陰性菌為檢測菌，通過菌落計(jì)數(shù)法測定其體外抗菌活性。結(jié)果表明，重組鴿AvBD5α和重組鴿AvBD5β蛋白對這12種細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制作用（p＜0.05或p＜0.01）。其中重組鴿AvBD5α和重組鴿AvBD5β蛋白對金黃色葡萄球菌、多殺性巴士桿菌、奇異變型菌、綠膿桿菌的抗菌活性相對其他較強(qiáng)，二者對雞白痢沙門氏菌的抗菌活性較弱。重組鴿AvBD5α的抗菌活性與重組鴿AvBD5β無顯著差異。另外，經(jīng)檢測，標(biāo)簽蛋白GST對12種細(xì)菌均無