Angioarrestin的克隆表達及其生物學作用機理的初步研究.pdf

1、本課題運用基因工程技術，將從人肝cDNA文庫中克隆得到的angioareestin基因進行表達、純化并制備了相應的特異性抗angioarrestin抗體。在獲得了穩(wěn)定轉染angioarrestin及其C-端FDdomain的大細胞肺癌細胞株NCI-H460后，通過繪制細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)轉染細胞株與野生型及轉染空質粒的對照組細胞株相比，表現(xiàn)出一定的細胞生長緩慢特性。細胞粘附實驗和遷移實驗中，轉染FD細胞株還表現(xiàn)出細胞粘附能力增強，遷移率顯著

2、下降的特點，預示angioarrestin不僅具有抗血管形成活性，很有可能還具有一定的抑制腫瘤生長的活性。此外，通過RT-PCR手段還對受TNFα影響的內皮細胞中angioarrestin的表達調控進行了初步的探討。 一、Angioarrestin的克隆、表達與多克隆抗體的制備我們采用PCR技術從人肝pTRGcDNA文庫中獲得angioarestin及其末端FDdomain基因序列，分別構建pMAL-angioarrestin(

3、pMAL-ARP)和pMAL-FD重組質粒導入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，經IPTG誘導表達及2.5L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，親和層析，透析除鹽，AmiconUltra-15離心超濾管濃縮，凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?大腸桿菌表達的融合蛋白MBP/angioarrestin和MBP/FD在E.coliBL21中的菌體總蛋白含量分別為8.9％和38.5％，經純化后純度分別達87.6％和90.5％(Syngene掃描分析)。經Wers

4、ternBlot鑒定在96kDa和66kDa處得到相應的融合蛋白表達條帶。用Xa因子酶切融合蛋白后，分別得到分子量約為54kDa的angioarrestin蛋白和21kDa的FDdomain蛋白。 用上述純化的MBP/FD蛋白作為抗原，免疫Balb/c小鼠制備抗angioarrestin多克隆抗體。首次免疫，將弗式完全佐劑與PBS溶解的抗原溶液按1∶1比例混合，按每只小鼠30-50μg抗原劑量，0.3ml每只，于四肢腋窩，背部皮

5、下多點注射，0.05ml/點；之后，每隔10d以弗式不完全佐劑與抗原溶液按1∶1比例混勻，劑量減半分別進行第二次和第三次免疫；間隔7d，取一只小鼠摘眼球取血，離心取血清ELISA分析抗體效價，其余5只小鼠50-100μg抗原溶液直接腹腔注射加強免疫兩次，前后間隔一周。摘眼球取血，制備抗angioarrestin多克隆抗血清(鼠抗人)?？寡宸謩e經濃度為20％、50％、33％的硫酸銨鹽析，透析除鹽等步驟獲得純化的免疫球蛋白。經ELISA測

6、定抗體效價約為1∶1280，Westernblot驗證抗體對angioarrestin的特異性。 二、運用MBPpull-down尋找angioarrestin相互作用蛋白樣品分析結果表明，我們找到了三個與angioarrestin相互作用的候選蛋白，他們分別是Keratin2a(角蛋白2a)，macrophin1isoform2和breastcancerantigenNY-BR-1.1。經分析，認為macrophin1isof

7、orm2(Homosapiens)可能是一個比較具有研究意義的分子，該分子是一種由微絲和肌絲交聯(lián)的網格蛋白，為細胞骨架蛋白的一種。推測其很有可能介導angioarrestin在靶作用位點的錨定作用。 三、Angioarrestin的瞬時表達將構建的真核表達重組質粒pcDNA3.1-angioarrestin(pcDNA3.1-ARP)，pcDNA3.1-FD，對照pcDNA3.1-myc/hisB(-)經Lipofectamin

8、e2000轉染COS-7細胞，同時設立熒光表達重組質粒pEGFP-angioarrestin，pEGFP-FD，pEGFP-C2作為轉染效率參照。經流式細胞儀分析，轉染效率分別為9.83％、11.31％、13.11％。于含1％FBS的DMEM培養(yǎng)基37℃，5％CO2，培養(yǎng)72h。取轉染pcDNA3.1-angioarrestin的COS-7細胞培養(yǎng)上清經Ni2+柱層析純化后，行SDS-PAGE，繼而進行銀染處理和Westernblot分

9、析，采用ECL化學發(fā)光檢測信號。結果顯示與對照組相比，轉染目的基因的COS-7細胞上清中有一分子量約為66kD的特異性條帶。內皮細胞增殖實驗結果顯示，與轉染空質粒對照組相比，轉染angioarrestin的濃縮細胞培養(yǎng)上清液能明顯抑制內皮細胞的增殖。初步確定我們所表達的angioarrestin蛋白具有抑制內皮細胞增殖的抗血管形成活性。 四、Angioarrestin的穩(wěn)定轉染以構建的pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-

10、FD分別轉染NCI-H460細胞，加入含500μg/mlG418的選擇培養(yǎng)基，2～3周后挑選陽性克隆，進行RT-PCR、Westernblot及細胞免疫組化鑒定，獲得的陽性克隆細胞株分別被命名為ARP-H460和FD-H460，在含250μg/mlG418的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)并對細胞進行觀察。 五、Angioarrestin穩(wěn)定轉染與腫瘤細胞的生長5.1.對ARP及FD穩(wěn)定轉染大細胞肺癌細胞株繪制細胞生長曲線生長曲線中顯示野生型N

11、CI-H460和轉染pcDNA3.1-myc/hisB(-)的細胞之間細胞增殖無明顯差別(p＞0.05)，F(xiàn)D-H460細胞增殖速度明顯小于pcDNA3.1-myc/hisB(-)(p＜0.01)，但大于ARP-H460細胞的增殖速度(p＜0.01)。 5.2.不同組肺癌細胞粘附力的差異比較細胞分別鋪于FN，BSA包被24孔板1h后，F(xiàn)N包被孔內細胞粘附率顯著高于BSA包被孔；在FN包被孔內超過50％的細胞均己貼壁且細胞形態(tài)伸展

12、，與之相比，BSA包被孔內細胞大多仍為圓形且貼壁數量少。不同組間細胞粘附率比較，F(xiàn)D-H460細胞粘附率顯著高于轉染空白質粒pcDNA3.1組(p＜0.01)，也高于野生型NCI-H460(p＜0.05)。轉染ARP組與轉染空白質粒pcDNA3.1組粘附率相似，與野生型NCI-H460差異也不顯著。胰酶消化時間比較結果與粘附實驗基本一致。 5.3.劃痕法測定各組細胞株的遷移能力分別于24、48h在倒置相差顯微鏡下計數劃痕后遷移細

13、胞數，觀察結果顯示各組細胞呈現(xiàn)出不同的遷移能力，其中野生型NCI-H460細胞遷移數量最多，與pcDNA3.1相比，F(xiàn)D-H460細胞遷移數量顯著減少(p＜0.01)，ARP-H460細胞遷移數量也小于pcDNA3.1(p＜0.05)，pcDNA3.1與野生型NCI-H460細胞遷移數量差異不顯著(p＞0.05)。 六、TNFα對血管內皮細胞中angioarrestin表達的影響半定量RT-PCR法檢測TNFα誘導的angioa

14、rrestin表達情況。以β-actin為內參，檢測10ng/mlTNFα在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h作用情況下，對ECV304細胞中angioarrestinmRNA表達的影響；以及不同濃度0.1ng/ml、0.3ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、30ng/ml和50ng/mlTNFα作用細胞16h對angioarrestinmRNA表達的影響。結果表明，TNFα誘導內皮細胞angioarrestinmR

15、NA表達具有一定的時間和劑量依賴性，PCR產物經測序確定與GENBANK登錄序列一致。10ng/mlTNFα對angioarrestinmRNA誘導表達在16h作用后達到峰值，20h時開始下降。但在0-50ng/mlTNFα濃度范圍內，angioarrestinmRNA表達呈劑量依賴型逐步升高趨勢。 總之，angioarrestin作為一種主要的內源性血管生成抑制物質，其在抑制內皮細胞增殖，遷移以及管狀結構形成等方面具有重要作用

16、。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉染angioarrestin及其C-端FDdomain的NCI-H460大細胞肺癌細胞株均顯示出一定生長緩慢特征。且FD轉染細胞的粘附率較對照組有顯著增加，細胞遷移能力降低。實驗還證明該分子mRNA表達水平受TNFα的影響，TNFα誘導的angioarrestinmRNA表達是一種時間和劑量依賴型模式。故推測angioarrestin可能具有與TNFα協(xié)同作用，在被TNFα激活后，通過抑制腫瘤血管的生長而在體內起