Angioarrestin的克隆表達(dá)及其生物學(xué)作用機(jī)理的初步研究.pdf

1、本課題運(yùn)用基因工程技術(shù)，將從人肝cDNA文庫(kù)中克隆得到的angioareestin基因進(jìn)行表達(dá)、純化并制備了相應(yīng)的特異性抗angioarrestin抗體。在獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染angioarrestin及其C-端FDdomain的大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460后，通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株與野生型及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞株相比，表現(xiàn)出一定的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢特性。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染FD細(xì)胞株還表現(xiàn)出細(xì)胞粘附能力增強(qiáng)，遷移率顯著

2、下降的特點(diǎn)，預(yù)示angioarrestin不僅具有抗血管形成活性，很有可能還具有一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性。此外，通過(guò)RT-PCR手段還對(duì)受TNFα影響的內(nèi)皮細(xì)胞中angioarrestin的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了初步的探討。 一、Angioarrestin的克隆、表達(dá)與多克隆抗體的制備我們采用PCR技術(shù)從人肝pTRGcDNA文庫(kù)中獲得angioarestin及其末端FDdomain基因序列，分別構(gòu)建pMAL-angioarrestin(

3、pMAL-ARP)和pMAL-FD重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及2.5L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，親和層析，透析除鹽，AmiconUltra-15離心超濾管濃縮，凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白MBP/angioarrestin和MBP/FD在E.coliBL21中的菌體總蛋白含量分別為8.9％和38.5％，經(jīng)純化后純度分別達(dá)87.6％和90.5％(Syngene掃描分析)。經(jīng)Wers

4、ternBlot鑒定在96kDa和66kDa處得到相應(yīng)的融合蛋白表達(dá)條帶。用Xa因子酶切融合蛋白后，分別得到分子量約為54kDa的angioarrestin蛋白和21kDa的FDdomain蛋白。 用上述純化的MBP/FD蛋白作為抗原，免疫Balb/c小鼠制備抗angioarrestin多克隆抗體。首次免疫，將弗式完全佐劑與PBS溶解的抗原溶液按1∶1比例混合，按每只小鼠30-50μg抗原劑量，0.3ml每只，于四肢腋窩，背部皮

5、下多點(diǎn)注射，0.05ml/點(diǎn)；之后，每隔10d以弗式不完全佐劑與抗原溶液按1∶1比例混勻，劑量減半分別進(jìn)行第二次和第三次免疫；間隔7d，取一只小鼠摘眼球取血，離心取血清ELISA分析抗體效價(jià)，其余5只小鼠50-100μg抗原溶液直接腹腔注射加強(qiáng)免疫兩次，前后間隔一周。摘眼球取血，制備抗angioarrestin多克隆抗血清(鼠抗人)。抗血清分別經(jīng)濃度為20％、50％、33％的硫酸銨鹽析，透析除鹽等步驟獲得純化的免疫球蛋白。經(jīng)ELISA測(cè)

6、定抗體效價(jià)約為1∶1280，Westernblot驗(yàn)證抗體對(duì)angioarrestin的特異性。 二、運(yùn)用MBPpull-down尋找angioarrestin相互作用蛋白樣品分析結(jié)果表明，我們找到了三個(gè)與angioarrestin相互作用的候選蛋白，他們分別是Keratin2a(角蛋白2a)，macrophin1isoform2和breastcancerantigenNY-BR-1.1。經(jīng)分析，認(rèn)為macrophin1isof

7、orm2(Homosapiens)可能是一個(gè)比較具有研究意義的分子，該分子是一種由微絲和肌絲交聯(lián)的網(wǎng)格蛋白，為細(xì)胞骨架蛋白的一種。推測(cè)其很有可能介導(dǎo)angioarrestin在靶作用位點(diǎn)的錨定作用。 三、Angioarrestin的瞬時(shí)表達(dá)將構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-angioarrestin(pcDNA3.1-ARP)，pcDNA3.1-FD，對(duì)照pcDNA3.1-myc/hisB(-)經(jīng)Lipofectamin

8、e2000轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立熒光表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-angioarrestin，pEGFP-FD，pEGFP-C2作為轉(zhuǎn)染效率參照。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，轉(zhuǎn)染效率分別為9.83％、11.31％、13.11％。于含1％FBS的DMEM培養(yǎng)基37℃，5％CO2，培養(yǎng)72h。取轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-angioarrestin的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)Ni2+柱層析純化后，行SDS-PAGE，繼而進(jìn)行銀染處理和Westernblot分

9、析，采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染目的基因的COS-7細(xì)胞上清中有一分子量約為66kD的特異性條帶。內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染angioarrestin的濃縮細(xì)胞培養(yǎng)上清液能明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。初步確定我們所表達(dá)的angioarrestin蛋白具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抗血管形成活性。 四、Angioarrestin的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以構(gòu)建的pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-

10、FD分別轉(zhuǎn)染NCI-H460細(xì)胞，加入含500μg/mlG418的選擇培養(yǎng)基，2～3周后挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行RT-PCR、Westernblot及細(xì)胞免疫組化鑒定，獲得的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株分別被命名為ARP-H460和FD-H460，在含250μg/mlG418的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。 五、Angioarrestin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)5.1.對(duì)ARP及FD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)曲線中顯示野生型N

11、CI-H460和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc/hisB(-)的細(xì)胞之間細(xì)胞增殖無(wú)明顯差別(p＞0.05)，F(xiàn)D-H460細(xì)胞增殖速度明顯小于pcDNA3.1-myc/hisB(-)(p＜0.01)，但大于ARP-H460細(xì)胞的增殖速度(p＜0.01)。 5.2.不同組肺癌細(xì)胞粘附力的差異比較細(xì)胞分別鋪于FN，BSA包被24孔板1h后，F(xiàn)N包被孔內(nèi)細(xì)胞粘附率顯著高于BSA包被孔；在FN包被孔內(nèi)超過(guò)50％的細(xì)胞均己貼壁且細(xì)胞形態(tài)伸展

12、，與之相比，BSA包被孔內(nèi)細(xì)胞大多仍為圓形且貼壁數(shù)量少。不同組間細(xì)胞粘附率比較，F(xiàn)D-H460細(xì)胞粘附率顯著高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pcDNA3.1組(p＜0.01)，也高于野生型NCI-H460(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染ARP組與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pcDNA3.1組粘附率相似，與野生型NCI-H460差異也不顯著。胰酶消化時(shí)間比較結(jié)果與粘附實(shí)驗(yàn)基本一致。 5.3.劃痕法測(cè)定各組細(xì)胞株的遷移能力分別于24、48h在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)劃痕后遷移細(xì)

13、胞數(shù)，觀察結(jié)果顯示各組細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的遷移能力，其中野生型NCI-H460細(xì)胞遷移數(shù)量最多，與pcDNA3.1相比，F(xiàn)D-H460細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少(p＜0.01)，ARP-H460細(xì)胞遷移數(shù)量也小于pcDNA3.1(p＜0.05)，pcDNA3.1與野生型NCI-H460細(xì)胞遷移數(shù)量差異不顯著(p＞0.05)。 六、TNFα對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中angioarrestin表達(dá)的影響半定量RT-PCR法檢測(cè)TNFα誘導(dǎo)的angioa

14、rrestin表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)10ng/mlTNFα在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h作用情況下，對(duì)ECV304細(xì)胞中angioarrestinmRNA表達(dá)的影響；以及不同濃度0.1ng/ml、0.3ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、30ng/ml和50ng/mlTNFα作用細(xì)胞16h對(duì)angioarrestinmRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，TNFα誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞angioarrestinmR

15、NA表達(dá)具有一定的時(shí)間和劑量依賴(lài)性，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序確定與GENBANK登錄序列一致。10ng/mlTNFα對(duì)angioarrestinmRNA誘導(dǎo)表達(dá)在16h作用后達(dá)到峰值，20h時(shí)開(kāi)始下降。但在0-50ng/mlTNFα濃度范圍內(nèi)，angioarrestinmRNA表達(dá)呈劑量依賴(lài)型逐步升高趨勢(shì)。 總之，angioarrestin作為一種主要的內(nèi)源性血管生成抑制物質(zhì)，其在抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移以及管狀結(jié)構(gòu)形成等方面具有重要作用

16、。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染angioarrestin及其C-端FDdomain的NCI-H460大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株均顯示出一定生長(zhǎng)緩慢特征。且FD轉(zhuǎn)染細(xì)胞的粘附率較對(duì)照組有顯著增加，細(xì)胞遷移能力降低。實(shí)驗(yàn)還證明該分子mRNA表達(dá)水平受TNFα的影響，TNFα誘導(dǎo)的angioarrestinmRNA表達(dá)是一種時(shí)間和劑量依賴(lài)型模式。故推測(cè)angioarrestin可能具有與TNFα協(xié)同作用，在被TNFα激活后，通過(guò)抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)而在體內(nèi)起