雞骨保護(hù)素（chOPG）基因的克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、骨保護(hù)素(OPG)最先發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物，是一種能抑制破骨前體細(xì)胞分化、抑制成熟破骨細(xì)胞活性并誘導(dǎo)其凋亡的分泌型糖蛋白。體內(nèi)調(diào)節(jié)骨代謝的許多激素和細(xì)胞因子最終通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL的表達(dá)而發(fā)揮作用。鑒于OPG在骨代謝中的重要調(diào)節(jié)作用，本文旨在克隆表達(dá)蛋雞OPG蛋白，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行研究，有望為蛋雞骨質(zhì)疏松癥的防治提供新的治療手段。 1．建立簡(jiǎn)便有效的雞胚破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為雞骨保護(hù)素的生物活性研究及籠養(yǎng)蛋雞骨質(zhì)疏松癥研究

2、提供新的試驗(yàn)手段。主要剔取18日齡雞胚的長(zhǎng)骨，縱向剖開，吹打長(zhǎng)骨內(nèi)表面，獲取一定數(shù)量細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)板，2 h后棄去未貼壁細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞具有破骨細(xì)胞樣特點(diǎn)：為多核大細(xì)胞，有油煎蛋形、啞鈴形、橢圓形；TRAP染色陽(yáng)性，能在骨片表面形成吸收陷窩。 2．在體外成功培養(yǎng)雞胚破骨細(xì)胞的基礎(chǔ)上，體外直接研究依普拉芬、地塞米松對(duì)成熟破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響。以不同濃度的依普拉芬、地塞米松與原代分離的破骨細(xì)胞共培養(yǎng)

3、6天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10<'-7>-10<'-9>M的依普拉芬可顯著抑制破骨細(xì)胞性骨吸收、使骨吸收陷窩數(shù)目和面積減少，并呈劑量依賴關(guān)系；而10<'-5>-10<'-8>M的地塞米松則促進(jìn)破骨細(xì)胞性骨吸收、增加骨吸收陷窩數(shù)目面積，亦呈劑量依賴關(guān)系。 3．應(yīng)用RT-PcR方法從體外培養(yǎng)雞胚成骨細(xì)胞中擴(kuò)增出雞OPG基因(Genbank登錄號(hào)，DQ098013)，然后將特異性片段連接到pMD18-T載體，經(jīng)酶切、PCR鑒定及DNA序列測(cè)定。

4、結(jié)果表明，擴(kuò)增片段包含完整的ORF，與Genbank上登錄的雞OPG(XM_418394)同源性為99.3％；同時(shí)對(duì)雞、人、大鼠和小鼠OPG氨基酸序列進(jìn)行了多序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，雞OPG和人OPG的一致性為69.65％，與大鼠及小鼠OPG的一致性均為65.51％。OPG基因的成功擴(kuò)增為接下來該蛋白的重組表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。 4．設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于亞克隆雞OPG成熟蛋白編碼基因(不含信號(hào)肽)，然后構(gòu)建雞OPG原核表達(dá)載體pET-32

5、a(+)-chOPGm，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組雞OPG成熟蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，原核表達(dá)產(chǎn)物為63 kD的重組蛋白，以包涵體形式存在，薄層掃描顯示OPG占菌體總蛋白的11.9％，western blotting分析顯示，表達(dá)的OPG蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。以經(jīng)鎳離子親和層析柱純化的OPG蛋白免疫新西蘭白兔，制備抗OPG多克隆抗體，ELISA結(jié)果顯示抗體效價(jià)達(dá)到1：10240。Western印跡結(jié)果表明，該抗體可以和雞OP

6、G酵母表達(dá)產(chǎn)物特異性結(jié)合。 5．設(shè)計(jì)另一對(duì)引物用于亞克隆雞OPG成熟蛋白編碼基因(不含信號(hào)肽)，然后構(gòu)建雞OPG真核表達(dá)載體pPICZa-A-chOPGm’，以電穿孔法轉(zhuǎn)化酵母X-33，用Zeocin平板篩選重組子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物，由于糖基化不同，表達(dá)產(chǎn)物有兩種，其相對(duì)分子量分別為43kD和53kD，表達(dá)量約為200mg/L，經(jīng)Western印跡驗(yàn)證，有較好的抗原性。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)處理后加入

7、到體外培養(yǎng)的雞胚破骨細(xì)胞上，能顯著抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性，使骨吸收陷窩個(gè)數(shù)和面積均減少，證實(shí)表達(dá)的OPG蛋白具有抑制成熟破骨細(xì)胞骨吸收活性的功能。 6．100羽56周齡ISA蛋雞分為5組，A組為對(duì)照組，B、C、D、E組每隔3 d肌肉注射劑量分別為100μg、200μg、300μg、400μg的雞骨保護(hù)素酵母表達(dá)凍干產(chǎn)物水溶物。每周采血測(cè)血鈣、血磷、堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和骨鈣素。每天記錄產(chǎn)蛋量、破殼蛋數(shù)，測(cè)定蛋殼強(qiáng)

8、度和厚度。最后測(cè)定骨生物力學(xué)性能和骨密度。結(jié)果表明：B、C兩組總平均產(chǎn)蛋率顯著高于對(duì)照組和其它實(shí)驗(yàn)組。與A組相比，用藥組總平均軟破殼蛋率下降，其中B、C兩組差異顯著。各組蛋殼厚度和強(qiáng)度無(wú)明顯差異；用藥組血鈣顯著低于對(duì)照組，血磷無(wú)明顯差異； B、C、D組堿性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組； C、D兩組骨鈣素水平顯著高于對(duì)照組；E組抗酒石酸酸性磷酸酶活性顯著低于對(duì)照組；C組脛骨生物力學(xué)性能和放射骨密度顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：適當(dāng)劑量(約200μg)