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文檔簡介
1、北京作為我國首都、國際化大都市擁有數(shù)量龐大的MSM群體;河北地處北京與河南之間,早年受到河南有償獻(xiàn)血人群影響HIV從南部傳入,近年來當(dāng)?shù)豈SM人群與北京MSM人群之間聯(lián)系緊密;深圳毗鄰香港,是我國最早的經(jīng)濟(jì)特區(qū),流動人口數(shù)量龐大,2012年發(fā)現(xiàn)的新型流行重組毒株CRF55_01B的起源地。本研究利用源自上述3個(gè)地區(qū)HIV感染者/艾滋病病患者的血漿標(biāo)本及其產(chǎn)出的病毒基因序列,采用多種生物信息學(xué)分析方法,研究這三個(gè)地區(qū)HIV-1毒株的流行和
2、進(jìn)化特征,并建立新型重組毒株的感染性克隆,以期闡明我國不同類型地區(qū)HIV進(jìn)化特點(diǎn)和流行情況,并為致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
第一部分 北京MSM人群HIV流行動力學(xué)研究
本研究旨在分析北京MSM人群中流行的HIV-1毒株的流行動力學(xué)以及進(jìn)化特征。
結(jié)果:(1)北京MSM人群中流行的HIV-1毒株包括B、CRF01 AE和CRF07_BC。(2)在全國HIV毒株的ML進(jìn)化樹中,有3個(gè)北京MSM簇(系統(tǒng)發(fā)育樹中分支
3、節(jié)點(diǎn)SH值≥90%,序列數(shù)量≥40條定義為簇;如果簇中北京MSM人群的序列數(shù)最多則定義為北京MSM簇),即B-1簇、01_AE-1簇、01_AE-2簇,MSM人群序列所占的比例分別為72%、64%和41%。在01_AE-1簇內(nèi)有一個(gè)本地簇(01_AE-1-2),其中北京MSM所占的比例(63%)顯著高于01_AE-2簇(P=0.002,x2=9.2972)。(3) B-1簇毒株是經(jīng)過至少3次傳入事件進(jìn)入北京MSM人群的,傳入時(shí)間是199
4、1年3月(1984年7月~1997年2月)、1994年1月(1990年5月~1999年3月)和1994年12月(1989年5月~1998年4月)。CRF01_AE毒株進(jìn)入北京MSM人群是經(jīng)過兩次傳入事件,發(fā)生時(shí)間01_AE-1簇為2000年11月(1999年6月~2002年2月)、01_AE-2簇為2000年6月(1999年4月~2001年6月);值得注意的是在2003年5月(2002年9月~2004年1月)01_AE-1簇內(nèi)形成一個(gè)穩(wěn)
5、定的本地簇01_AE-1-2簇。(4)01_AE-1簇突變速率高于其他兩簇,流行特征重塑分析顯示,01_AE-1簇增長持續(xù)至2008年,01_AE-1-2簇增長持續(xù)至2007年,01_AE-2簇從2003年開始增長持續(xù)至2006年。3簇R值(effective reproductive number)在2008年左右后小于1,但是刪除01_AE-1-2簇中異性性傳播人群序列后R值在2010年出現(xiàn)回升。
結(jié)論:北京MSM人群中存
6、在多種HIV亞型毒株流行,雖然B亞型毒株傳入時(shí)間最早,但近年來傳播趨勢趨于平穩(wěn);CRF01_AE毒株傳入時(shí)間雖然較晚,但增長迅速,對HIV在北京地區(qū)的流行具有明顯的推動作用。因此對CRF01_AE毒株的防控,對MSM人群采取行之有效的干預(yù)措施將有助于減少該地區(qū)HIV的流行。
第二部分 河北省不同高危人群中HIV流行毒株的關(guān)系分析
在本研究中我們利用從河北不同高危人群中獲得的106份HIV-1陽性血漿標(biāo)本,逆轉(zhuǎn)錄PCR
7、擴(kuò)增獲得96份標(biāo)本的gag、pol全長基因片段并測序,使用phyml3.0等軟件分析病毒在不同人群中的特征以及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,以期了解不同高危人群之間傳播關(guān)系。
結(jié)果:(1)對亞型分析結(jié)果顯示B亞型為河北最主要的流行毒株(52.08%),之后依次是CRF01_AE(34.4%)、CRF07_BC(6.3%)、C亞型(4.2%)、CRF02_AG(1.0%)、CRF08_ BC(1.0%)以及URF(1.0%)。異性性傳播包含所有
8、發(fā)現(xiàn)的亞型,不同人群中亞型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確檢驗(yàn)p<0.001)。(2)進(jìn)化關(guān)系分析顯示河北HIV-1毒株可以分為6簇,分別為:2個(gè)B亞型簇,2個(gè)CRF01_ AE簇,1個(gè)CRF07_BC簇和1個(gè)C亞型簇,說明河北的HIV-1流行是多次輸入導(dǎo)致。河北異性性傳播人群分散在各個(gè)高危人群之中,自身不獨(dú)立成簇;各高危人群在進(jìn)化樹中與國內(nèi)其他地區(qū)相同感染途徑人群聯(lián)系緊密。
結(jié)論:河北發(fā)現(xiàn)多種HIV基因型毒株,HIV
9、的流行呈多樣性。異性性傳播與其他高危人群聯(lián)系緊密,HIV從高危人群向普通人群擴(kuò)散。河北HIV毒株的遺傳特征將有助于了解我國的HIV分布及進(jìn)化特點(diǎn),同時(shí)為我國HIV疫苗設(shè)計(jì)提供序列信息。
第三部分 深圳市性傳播人群中HIV-1流行毒株的多樣性研究
本研究在2013年采集深圳市HIV-1陽性血漿標(biāo)本250份,逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增測序獲得198份標(biāo)本的gag/pol全長基因序列,利用gag與pol全長基因使用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)
10、發(fā)育樹分析毒株進(jìn)化特征;使用RIP、genotyping tool、jpHMM-HIV等工具分析URF毒株基因結(jié)構(gòu)。
結(jié)果:(1)本次研究的深圳HIV感染者以男性為主(87.37%),平均年齡33歲,以異性性傳播人群、MSM人群為主。與異性性傳播人群相比,MSM人群的平均年齡低(32.5歲)、未婚比例高(81.58%)、學(xué)歷層次高。(2)亞型分析結(jié)果顯示CRF01_AE與CRF07_BC占總體的69.7%,其次是由深圳起源的C
11、RF55_01B26例(13.13%),其他亞型毒株包括B亞型、D亞型、CRF08_ BC、CRF59_01B以及在性傳播途徑中發(fā)現(xiàn)的13例URF(6.57%),13例URF毒株有9例是由CRF01_ AE、B亞型、C亞型重組而成。異性性傳播人群中包含所有流行亞型以及5例URF。(3)進(jìn)化關(guān)系分析顯示,深圳MSM人群中CRF01_ AE、B亞型毒株系由北京地區(qū)傳入,而后形成人群內(nèi)部流行。CRF07_BC毒株中深圳本地MSM人群和本地異性
12、性傳播人群關(guān)系緊密,不能證明深圳MSM人群與北京MSM人群有直接聯(lián)系;深圳異性性傳播人群與北京地區(qū)MSM人群聯(lián)系緊密。CRF55_01B中MSM人群與異性性傳播人群聯(lián)系緊密,該毒株已經(jīng)在深圳異性性傳播中流行。在CRF01_ AE、CRF08_ BC中各有一簇由異性性傳播人群組成,比較這兩簇中異性性傳播人群與MSM人群為主的傳播簇中異性性傳播人群的學(xué)歷,發(fā)現(xiàn)MSM人群為主的傳播簇中異性性傳播人群普遍年輕、學(xué)歷較高、未婚。
結(jié)論:
13、深圳HIV-1毒株基因型具有豐富的多樣性,包含中國所有主要流行毒株以及深圳起源的CRF55_01B。性傳播人群中豐富的HIV-1基因型使得深圳出現(xiàn)較高比例URF毒株,基因結(jié)構(gòu)相似的兩例URF出現(xiàn)提示該毒株可能已經(jīng)發(fā)生傳播,對于新型重組毒株的發(fā)生和流行應(yīng)該予以高度警惕。MSM人群中HIV-1毒株已經(jīng)向異性性傳播人群擴(kuò)散,CRF07_ BC毒株、CRF55_01B毒株中MSM人群與異性性傳播人群聯(lián)系緊密,深圳性傳播人群HIV-1防控形勢極為
14、嚴(yán)峻。異性傳播簇中異性傳播人群與MSM簇中的異性性傳播人群可能屬于不同的社會階層,這個(gè)群體可能主要為文化水平低、經(jīng)濟(jì)收入低、主要從事體力勞動、活動范圍有限的人群,很可能通過低端異性性服務(wù)感染。
第四部分 構(gòu)建深圳流行HIV-1毒株的全長基因克隆
我們從3例深圳HIV感染者/AIDS病人的血液樣本中提取純化基因組DNA,擴(kuò)增獲得HIV-1兩個(gè)半分子序列,然后分別進(jìn)行T載體連接構(gòu)建質(zhì)粒,再使用xhoI和AarI限制性內(nèi)切
15、酶對兩個(gè)半分子質(zhì)粒進(jìn)行酶切,獲得兩個(gè)目的條帶后利用T4連接酶連接,最后轉(zhuǎn)化包裝成為全長質(zhì)粒。將對全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,ELISA法測定培養(yǎng)上清液中的HIV-1 P24抗原,監(jiān)測病毒復(fù)制。
結(jié)果:(1)成功構(gòu)建3個(gè)全長克隆(S79745bp、S139720 bp、S159709 bp),S7基因型為CRF55_01B,S13是URF毒株由CRF01_ AE和B亞型重組而成,S15也是URF毒株由CRF01AE、B亞型和C亞型
16、重組而成。(2) S7、S13、S15都是以CRF01_ AE為骨架在2953位至3340位插入B亞型片段,雖然在3732位也都插入B亞型片段,但是S7插入的長度要大于S13和15,而S13和S15插入的B片段長度一致。同時(shí)S15在1177位至2005位、4345位至4792位插入C亞型片段。(3)對S13和S15的基因片段來源進(jìn)行分析,S13、S15中B亞型片段全部來自于CRF55_01B,S15中C亞型片段來自于CRF07_ BC,
17、而骨架CRF01_ AE可能是由CRF55_01B重組而來。(4)經(jīng)多次轉(zhuǎn)染均未獲得具有感染性的包裝病毒。
結(jié)論:獲得3株深圳HIV-1毒株的全基因組克隆,由CRF01_AE與B亞型及CRF01_ AE、B亞型、C亞型片段重組產(chǎn)生的URF毒株中B亞型片段可能來自CRF55_01B毒株,C亞型片段可能來自于CRF07_ BC毒株,而CRF01_ AE片段也有可能來自于CRF55_01B毒株。全長克隆方法的構(gòu)建為進(jìn)一步構(gòu)建感染性克
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