可溶性TRAIL的表達(dá)、純化及其對(duì)三種大腸癌細(xì)胞作用的初步分析.pdf

1、目的：
　　1.表達(dá)并純化較高活性的TRAIL蛋白，優(yōu)化表達(dá)條件。
　　2.觀察TRAIL對(duì)大腸癌細(xì)胞HCT116、SW480和SW620細(xì)胞增殖的影響，并對(duì)機(jī)制進(jìn)行初步分析。
　　方法：
　　1. TRAIL的表達(dá)與純化。
　　擴(kuò)大培養(yǎng)含pET-d-TRAIL質(zhì)粒的大腸桿菌DH5?，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析和離子交換層析純化。利用MTT法測定純化產(chǎn)物對(duì)大腸癌細(xì)胞SW4

2、80增殖的影響。分別改變誘導(dǎo)劑 IPTG的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，從而確定誘導(dǎo)TRAIL的最適條件。在親和層析過程中采用兩種洗脫TRAIL的方式，并改變透析的時(shí)間，對(duì)比以上條件對(duì)TRAIL活性的影響。
　　2.初步分析TRAIL對(duì)HCT116、SW480和SW620的增殖的影響。
　　在HCT116、SW480和SW620三種大腸癌細(xì)胞中分別加入0、100、200和400?g/ml的TRAIL，培養(yǎng)12 h后，光鏡下觀察TRAIL對(duì)

3、細(xì)胞形態(tài)的影響；MTT法測定TRAIL對(duì)細(xì)胞增殖的影響；用 western blot檢測三種細(xì)胞中 DR5、caspase-3、caspase-6、caspase-7、caspase-8和XIAP的蛋白表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染caspase-8質(zhì)粒至SW620細(xì)胞，進(jìn)一步觀察高表達(dá)caspase-8的SW620細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感性。
　　結(jié)果：
　　1.確定最適誘導(dǎo)條件：TRAIL工程菌在培養(yǎng)4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，在IPTG濃度為

4、0.5 mmol/L條件下37℃誘導(dǎo)6 h，TRAIL的蛋白表達(dá)量占總蛋白的比例達(dá)到20％。
　　2.純化出純度高于95%的可溶性TRAIL蛋白。
　　3.在細(xì)胞生長處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)分別加入0、100、200和400?g/ml的TRAIL并培養(yǎng)12 h。MTT實(shí)驗(yàn)顯示HCT116的細(xì)胞活力分別為對(duì)照組的65%、28%、6%。SW480細(xì)胞的活力分別為對(duì)照組的85%、65%、42%。SW620的細(xì)胞活力分別為對(duì)照組的95%、9

5、4%、91%。
　　4. Western blot顯示HCT116、SW480、SW620中caspase-3、caspase-6、caspase-7和caspase-8的蛋白表達(dá)量逐漸降低，DR5的蛋白表達(dá)量則逐漸升高，XIAP的表達(dá)水平從高到低則依次為SW480、SW620和HCT116。
　　5. SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染caspase-8后，在100?g/ml TRAIL作用下，細(xì)胞活力降低了33%。
　　結(jié)論：