水溶性CdTe量子點(diǎn)的制備及對(duì)大腸癌細(xì)胞的免疫成像研究.pdf

1、目的：大腸癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在我國(guó)已位居第3位，建立有效的早期檢測(cè)的方法，以實(shí)現(xiàn)早期診斷、早期治療是提高患者生存率的關(guān)鍵。本研究采用水相合成方法制備CdTe量子點(diǎn)，并將其與單克隆抗體ND—1偶聯(lián)，制備大腸癌細(xì)胞相關(guān)抗原LEA的特異性熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸癌細(xì)胞的高靈敏度檢測(cè)，為大腸癌的早期診斷及成像研究提供新的方法和途徑。 方法：⑴在0℃無(wú)氧條件下合成NaHTe前軀體，以前軀體為核心合成量子點(diǎn)溶液，并在140℃條件下加

2、熱不同時(shí)間以獲得不同粒度的量子點(diǎn)。⑵量子點(diǎn)的紫外可見吸收光譜及熒光光譜進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)熒光光譜譜峰估算出量子點(diǎn)的粒徑；對(duì)140℃加熱195min制備的QD613進(jìn)行TEM檢測(cè)。⑶雌性BALB/C小鼠腹腔內(nèi)接種分泌ND—1的雜交瘤細(xì)胞株IC2，每只小鼠注射0.5ml，細(xì)胞濃度為1～2×106/ml，10-20日后陸續(xù)于腹腔抽取腹水。⑷腹水中加入CaCl2及離心去除蛋白纖維凝塊，24h透析后經(jīng)過(guò)HiTrap protein G柱親和層析純化

3、單克隆抗體。純化后抗體經(jīng)超濾調(diào)整至適宜溫度及置換緩沖液為PBS，4℃?zhèn)溆没颉?0℃長(zhǎng)期保存。SDS-PAGE鑒定單克隆抗體純度。Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。⑸以純化的單克隆抗體為一抗，羊抗小鼠FITC—IgG為二抗分別孵育CCL187細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光成像，以檢測(cè)單克隆抗體ND—1的免疫活性。⑹采用EDAC連接法，使量子點(diǎn)QD613的巰基乙酸羧基基團(tuán)—COOH與單克隆抗體ND—1末端的伯胺—NH2共價(jià)反應(yīng)。⑺采用Se

4、phacryl S—200凝膠進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，對(duì)量子點(diǎn)與單克隆抗體ND—1的偶聯(lián)產(chǎn)物QD613—ND—1進(jìn)行分離純化。⑻以水溶性CdTe量子點(diǎn)與單克隆抗體ND—1偶聯(lián)產(chǎn)物QD613—ND—1為熒光探針，對(duì)特異性高表達(dá)LEA的大腸癌細(xì)胞CCL187進(jìn)行特異性免疫熒光成像，分別以未偶聯(lián)抗體ND—1的CdTe量子點(diǎn)QD613孵育CCL187細(xì)胞，及QD613—ND—1熒光探針孵育LEA表達(dá)陰性的HeLa細(xì)胞作為對(duì)照組。⑼以488nm激發(fā)光持

5、續(xù)激發(fā)QD613和FITC為熒光標(biāo)記的CCL187細(xì)胞，共聚焦顯微鏡以285s為間隔自動(dòng)連續(xù)采集圖象，每個(gè)樣品共采集圖象12幅。 結(jié)果：①140℃條件下加熱75min，95min，115min，135nun，155min，175min及195min，獲得了在紫外光激發(fā)下熒光顏色從綠色漸變至黃色、橙色和紅色的CdTe量子點(diǎn)。隨著加熱時(shí)間的增加，量子點(diǎn)不斷生長(zhǎng)增大，發(fā)射峰位紅移，表現(xiàn)出明顯的量子尺寸效應(yīng)。②隨著制備中加熱時(shí)間的增加，

6、吸收光譜發(fā)生紅移，獲得不同粒徑不同顏色熒光的CdTe量子點(diǎn)；每種量子點(diǎn)吸收峰明顯，粒度均勻；吸收光譜不是單吸收峰，而是寬范圍的吸收譜，有助于一元激發(fā)，多元發(fā)射——以一種激發(fā)波長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)多色成像。③隨著制備中加熱時(shí)間的增加，發(fā)射光譜譜發(fā)生紅移；發(fā)射峰對(duì)稱，最大半峰寬均在35—55nm之間，表現(xiàn)出較窄的尺寸分布。④合成的量子點(diǎn)為球形，粒徑分布較均勻，平均粒徑為3.93±0.14nm，與根據(jù)估算公式計(jì)算出的量子點(diǎn)粒徑基本一致。⑤被純化的單抗SDS

7、-PAGE上呈現(xiàn)均一的兩條帶：一條為55kDa，另一條為25kDa，分別為IgG抗體的重鏈與輕鏈。凝膠成像掃描顯示其純度達(dá)到95％。⑥采用免疫熒光方法，以單克隆抗體ND—1作為一抗，羊抗小鼠FITC—IgG作為二抗孵育LEA陽(yáng)性CCL187細(xì)胞，在CCL187細(xì)胞表面呈現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)；以PBS代替單克隆抗體ND—1作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠IgG作為二抗孵育CCL187細(xì)胞，以及以單克隆抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠IgG作為

8、二抗孵育LEA表達(dá)陰性的HeLa細(xì)胞，均無(wú)特異性結(jié)合熒光信號(hào)，以上結(jié)果證明純化的單克隆抗體ND—1具有免疫學(xué)活性。⑦采用EDAC連接法，使量子點(diǎn)QD613的巰基乙酸羧基基團(tuán)—COOH與單克隆抗體ND—1末端的伯胺—NH2共價(jià)反應(yīng)。選擇了以pH7.4 PBS作為活化緩沖液。⑧采用Sephacryl S—200凝膠進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，對(duì)量子點(diǎn)與單克隆抗體ND—1的有效偶聯(lián)進(jìn)行了鑒定，對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物QD613—ND—1進(jìn)行了初步的分離純化。⑨采用免

9、疫熒光方法，QD613—ND—1對(duì)CCL187細(xì)胞表面顯示特異性的熒光信號(hào)；QD613—ND—1對(duì)HeLa細(xì)胞，及QD613對(duì)CCL187細(xì)胞，細(xì)胞膜均未顯示特異性熒光信號(hào)。表明QD613—ND—1與LEA陽(yáng)性的CCL187細(xì)胞表面的結(jié)合是特異性結(jié)合。⑩將QD613—ND—1與不同濃度單克隆抗體ND—1進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)。隨著ND—1濃度的降低，CCL187細(xì)胞表面QD613紅色熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，QD613—ND—1與CCL187細(xì)胞表