不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞形態(tài)和基因表達譜的差異分析.pdf

1、基因芯片又稱DNA芯片，是最先研究也是較為成熟的一種生物芯片，以高通量、高靈敏度、并行檢測為特點，在大腸癌及其它惡性腫瘤中應用廣泛。通過基因芯片構建腫瘤相關基因表達譜，研究腫瘤相關基因和轉(zhuǎn)移相關基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的功能，揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的規(guī)律，為腫瘤病原、病因、病理學研究，各種腫瘤的臨床診斷、治療藥物篩選、預后判斷、治療效果監(jiān)測甚至腫瘤預防等領域的研究開辟了廣闊的前景。本文主要對基因芯片技術在大腸癌轉(zhuǎn)移研究中的應用進行綜

2、述。 結腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，目前大腸癌的治療手段和患者的預后雖然有了較大的改善，但術后局部復發(fā)與繼發(fā)的的淋巴道轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移仍是嚴重威脅患者生命的主要因素[1-2]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復雜的、多步驟的、腫瘤細胞與宿主相互作用的過程。在其轉(zhuǎn)移的每一步都涉及多個分子的相互作用以及不同基因在DNA或RNA水平上的一過性或永久性變化。因此，對轉(zhuǎn)移相關基因進行克隆和功能分析，不僅有利于闡述大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機理，而且還有望為臨床診

3、治、藥物篩選和預后判斷尋找新的靶點?；蛐酒某霈F(xiàn)，克服了傳統(tǒng)的基因檢測方法(如Southernblot，Northernblot和RT-PCR)費時、費力及針對基因數(shù)目少等諸多缺點，實現(xiàn)對靶基因信息的快速、自動化、批量化的檢測，獲得不同基因在表達上的相關性并通過生物信息學方法對表達譜檢測數(shù)據(jù)進行挖掘，從整體空間上把握與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關的基因及其表達、調(diào)控模式，推測和分析其生物學功能，篩選出腫瘤診斷、預后的分子標志物及治療的靶基

4、因，具有大規(guī)模、高效率的特點。本文主要對基因芯片技術在大腸癌轉(zhuǎn)移研究中的應用進行綜述。 1基因芯片概述 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個極其復雜、多步驟的、腫瘤細胞與宿主之間相互作用的過程，它涉及到原發(fā)腫瘤組織上異質(zhì)細胞亞群的選擇，腫瘤細胞粘附和運動性、抵御機體免疫殺傷、血管生成等多種腫瘤細胞的生物學行為。腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的過程中，腫瘤細胞的基因調(diào)控發(fā)揮著主導作用，轉(zhuǎn)移相關基因的表達和調(diào)控的結果是轉(zhuǎn)移表型的出現(xiàn)和細胞形態(tài)的變化。深入對腫瘤轉(zhuǎn)移

5、異質(zhì)性的機制研究，確定腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能及其相關因素對判斷預后、指導治療、提高患者生活質(zhì)量具有十分重要的意義。 相同遺傳背景、不同轉(zhuǎn)移潛能的細胞系可以排除和減低相關的實驗干擾，通過比較細胞形態(tài)、生物學特性、表達基因及蛋白差異等，可以確定腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因和蛋白，成為腫瘤轉(zhuǎn)移研究不可多得的理想模型。 本課題選擇具有相同遺傳背景的3個大腸癌細胞系(SW620、SW480和SW480/liver)作為研究對象，我們前期的裸鼠原位移植

6、實驗己證實，3個細胞系分別具有不同轉(zhuǎn)移的生物學特性，SW620細胞具有較高的淋巴結轉(zhuǎn)移的選擇性，而SW480細胞的異質(zhì)性較強，易形成廣泛的淋巴道、血道轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移，SW480/liver是本實驗室是從SW480細胞系中篩選獲得的具有高選擇肝轉(zhuǎn)移潛能的亞系。我們以SW480為參照母系，通過比較SW620、SW480/liver兩者之間形態(tài)學和基因表達譜的差異，探討它們在大腸癌轉(zhuǎn)移中作用及其相互關系。主要研究內(nèi)容和結果如下： 一、

7、不同轉(zhuǎn)移潛能不同的大腸癌細胞形態(tài)結構的差異分析 不同轉(zhuǎn)移潛能的癌細胞存在膜表面分子種類和數(shù)量等的差異，其超微結構的形態(tài)也必然存在或多或少的差異，為了解腫瘤細胞形態(tài)結構與轉(zhuǎn)移潛能是否存在相關性，我們在對3株大腸癌細胞系進行形態(tài)和表面超微結構觀測的同時，應用免疫組化檢測了Fascin、PCNA、CEA、CD44等的表達。由于腫瘤細胞與基質(zhì)黏附可影響細胞的形態(tài)，我們采用多聚賴氨酸包被的玻片和無任何處理載波片作為培養(yǎng)細胞的附著物，使黏附

8、對細胞的形態(tài)影響減低到最小程度。 二、不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞基因表達譜檢測及轉(zhuǎn)移相關基因的篩選 基因芯片技術是功能性基因研究的重要手段，能夠高通量、高效率、低消耗地對生物學信息進行快速分析處理，大規(guī)模的獲取相關生物信息，篩選癌癥發(fā)生、發(fā)展可能的相關基因，使研究能夠在基因組水平上以系統(tǒng)的、全局的觀念去研究分析腫瘤發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制。 基于Affymetrix芯片的可靠性，采用HG-U133Plus2.0原位合成寡核苷酸

9、芯片對SW620、SW480和SW480/liver細胞3個樣品的基因表達譜進行了檢測，以求從整體基因水平研究大腸癌轉(zhuǎn)移器官趨向性的作用機制。 三、大腸癌細胞基因表達譜生物信息學分析 大腸癌轉(zhuǎn)移部位主要是淋巴結和肝臟，這種親器官的轉(zhuǎn)移機制尚未完全明了，也是目前研究的熱點。通過對篩選的差異表達基因的生物信息學分析，從基因表達譜輪廓探討不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞基因表達特點以及篩查大腸癌轉(zhuǎn)移相關基因，為大腸癌的診斷、預后提供分子

10、生物學指標，并初步從整體基因網(wǎng)絡水平探討大腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制。 生物功能分析采用GOTM(GeneOntologyTreeMachine)在線軟件進行，GOTM它的特點是可以通過對上傳的基因和表達信號值進行統(tǒng)計分析，指出顯著相關富集基因群的GO分類域點，以提醒研究者進一步分析。 通過對篩查出的基因群生物功能分析，在兩組共同表現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的基因群主要涉及細胞代謝、細胞生理進程調(diào)節(jié)、信號傳導、大分子代謝、基本代謝和代謝調(diào)節(jié)等

11、，有一部分基因生物過程功能未知(ABCC4、KLF6、HOXA9、HSPCA、IFI27、KRT10、TM4SF1、SDC4)，由于這部分基因在兩組中存在共性表達，是否與轉(zhuǎn)移有關，還需進一步研究明確。 為進一步了解基因在細胞內(nèi)的功能和代謝結構，我們把篩選出的SW620差異表達2555的基因&EST上傳至PathwayExplorer，分析了解篩選基因在信號傳導路徑中的定位及作用。上傳的基因中有996個與537個信號傳導路徑的67

12、66基因中有效匹配達14.28％，沒有完全匹配的路徑，我們雖然應用是全基因組芯片，幾乎包含了全部已知的人類基因和EST，但我們上傳的是差異表達基因，因此，沒有匹配的基因不能說沒有表達，應該是這部分基因的表達值與SW480細胞接近。 另外，我們篩查出2個大腸癌轉(zhuǎn)移相關的候選基因：MALAT1和FMNL2。MALAT1是一個新鑒定的非編碼蛋白，染色體定位于11q13.1。MALAT1僅在SW620組高表達，可能與淋巴轉(zhuǎn)移相關。由于M

13、ALAT1的相關研究文獻較少，它具體的功能和表達的意義尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)MALAT1在早期非小細胞肺癌的高表達與轉(zhuǎn)移顯著相關，認為是早期非小細胞癌的預后預測因子。 綜合分析結果，參與淋巴轉(zhuǎn)移的大腸癌細胞似具有：細胞形態(tài)變形明顯，易于松解；細胞的黏附、趨向運動、移動調(diào)節(jié)酶活性(蛋白激酶、轉(zhuǎn)移酶)、金屬離子結合功能下降，核酸代謝、轉(zhuǎn)錄活性增高，表型應有：CTNNB1、EGFR、EREG下調(diào)，BCL2L1上調(diào)。 四、CD73

14、、CD24、Hsp27在大腸癌組織的表達及臨床病理意義 選擇在基因表達譜表達上調(diào)的CD73、CD24和Hsp27基因蛋白，應用免疫組化技術檢測了20例臨床未轉(zhuǎn)移性大腸癌和19例伴有淋巴結和肝臟轉(zhuǎn)移大腸癌3個部位癌組織的表達，以期評估同源性、不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細胞基因表達與在大腸癌組織表達的一致性，同時探討其臨床病理意義。 對19例大腸癌(含三個部位癌組織即原發(fā)灶、淋巴結和肝臟轉(zhuǎn)移灶)的CD24、Hsp27和CD73免疫組

15、化檢測結果表明，每個表型在淋巴結轉(zhuǎn)移灶和肝臟轉(zhuǎn)移灶癌組織的表達均有顯著差異(P＜0.05～＜0.001)，與SW620和SW480/liver在基因芯片檢測表達趨勢一致，即CD24在SW620(淋巴結轉(zhuǎn)移)中顯著上調(diào)，Hsp27和CD73在SW480/liver(肝轉(zhuǎn)移)表達上調(diào)，說明我們應用的同源性不同轉(zhuǎn)移潛能的細胞模型基因表達與人體大腸癌組織表達相一致，達到了初步驗證目的。 腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復雜、連續(xù)和可調(diào)節(jié)的過程，其中涉及

16、了多個宿主與腫瘤之間的相互作用，也涉及了許多的基因參與。隨著這些基因在大腸癌轉(zhuǎn)移過程中功能逐漸確定，將有助于開發(fā)新的治療策略。 結論 1，大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移與瘤細胞形態(tài)明顯變形，絲狀偽足多，易于松解有關；存在細胞黏附、趨向運動、移動調(diào)節(jié)酶活性(蛋白激酶、轉(zhuǎn)移酶)、金屬離子結合等方面功能下降和核酸代謝、轉(zhuǎn)錄活性增高。 2，大腸癌肝轉(zhuǎn)移與瘤細胞高增生狀態(tài)、較強的同質(zhì)黏附和侵襲能力相關，瘤細胞間黏附緊密可能是構建肝轉(zhuǎn)移潛能