XAF1在胃腸道腫瘤中的表達及其在大腸癌細胞中作用的初步研究.pdf

1、研究背景： 大腸癌是我國高發(fā)病率的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率有升高趨勢，死亡率居高不下。腫瘤的發(fā)生多伴隨或后繼于癌基因/抑癌基因的突變和表達調(diào)控的異常，突變包括基因缺失、移碼突變和點突變等，表達調(diào)控的異常在基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后的剪切及翻譯水平都可發(fā)生。 XAF1是由Liston等首先從酵母雙雜交系統(tǒng)中鑒定到的XIAP相關(guān)因子，能與XIAP直接結(jié)合拮抗其抑制caspase活性而起促進細胞凋亡的作用。近來的研究顯示XAF1尚有

2、XIAP非依賴性的促進腫瘤細胞凋亡的作用，并在腫瘤細胞中低表達或不表達，因此被認為是腫瘤抑制基因。目前發(fā)現(xiàn)XAF1的mRNA有5種轉(zhuǎn)錄(剪切)變異體XAF1A、XAF1B、XAF1CXAF1D和XAF1E：分別編碼不同的蛋白，XAF1A的研究較多，有促進腫瘤細胞凋亡的作用。有文獻報道XAF1B、XAF1C可能拮抗XAF1A的作用，而Chung等人報道XAF1B、XAF1C、XAF1D、XAF1E和XAF1A一樣均起促進細胞凋亡的作用。

3、 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞的分化、增殖與凋亡密切相關(guān)，因此探討腫瘤細胞分化、增殖或凋亡相關(guān)基因?qū)沂灸[瘤發(fā)生機制，探索腫瘤本質(zhì)及其在腫瘤治療中具有十分重要的科學意義。全反式維甲酸及干擾素是細胞分化誘導劑，同時全反式維甲酸及干擾素又能誘導XAF1A的表達，XAF1是否參與腫瘤細胞的分化目前尚無報道。 研究目的： 鑒于XAF1多個轉(zhuǎn)錄變異體在腫瘤中的作用及其在腫瘤細胞分化中的作用尚不明確，本實驗檢測XAF1三個轉(zhuǎn)錄變異

4、體XAF1A、XAF1B、XAF1C及XAF1A蛋白在胃腸道腫瘤細胞系中及大腸癌及癌前病變中的表達，并通過上調(diào)XAF1A在腫瘤細胞中的表達觀察XAF1A對腫瘤細胞增殖分化的影響，初步探討XAF1基因在腫瘤中的可能作用，為闡明大腸癌發(fā)生發(fā)展機制及腫瘤治療提供研究資料。 材料與方法： 1.材料：胃腸道腫瘤細胞株及正常轉(zhuǎn)化細胞：由本實驗保存；臨床石蠟組織標本(包括正常、腺瘤、癌組織)：本科室的病理室提供；新鮮胃腸道正常、息肉、

5、腫瘤及相應(yīng)的癌旁組織：南方醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心及手術(shù)室收集；pcDNA3.1/XAF1相關(guān)質(zhì)粒及熒光素酶報告基因相關(guān)質(zhì)粒：王繼德教授提供。 2.XAF1三個轉(zhuǎn)錄變異體在胃腸道腫瘤細胞系、大腸癌、癌前病變及經(jīng)過干擾素誘導后的MGC803細胞中的表達情況檢測：RT-PCR； 3.XAF1在胃腸道腫瘤細胞株及大腸腫瘤組織中的表達情況檢測：Westernblotting； 4.XAF1在大腸腫瘤組織、息肉組織及正常組織中的表

6、達情況檢測：免疫組織化學染色法； 5.脂質(zhì)體XAF1A穩(wěn)定和瞬時轉(zhuǎn)染SW480細胞系的構(gòu)建； 6.上調(diào)XAF1A對細胞增殖活性的影響檢測：MTT方法； 7.評估過表達XAF1A對survivin啟動子和catenin啟動子活性的影響：熒光素酶報告基因檢測技術(shù)； 8.過表達XAF1A對胃腸道腺癌分化指標E-cadherin、Villin、Pan-CEA蛋白的影響檢測：Westernblotting：

7、 9.統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS11.5軟件包處理數(shù)據(jù)，RT-PCR結(jié)果采用x2檢驗，Westernblotting結(jié)果采用單樣本t檢驗，免疫組化結(jié)果采用x2檢驗，MTT結(jié)果采用兩樣本t檢驗，以P≤0.05表示差別有統(tǒng)計學意義；熒光素酶報告基因結(jié)果采用兩樣本t檢驗，以P≤0.10表示差別有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.RT-PCR結(jié)果顯示在胃腸道腫瘤細胞株和正常轉(zhuǎn)化細胞中，XAF1三個轉(zhuǎn)錄變異體多不表達或低表達，在2株半懸浮細

8、胞株中，XAF1三個轉(zhuǎn)錄變異體均高表達。Westernblotting結(jié)果顯示，腫瘤細胞中XAF1A蛋白水平與其mRNA表達水平相一致，經(jīng)過干擾素誘導后，XAF1三個轉(zhuǎn)錄變異體的表達均升高； 2.RT-PCR結(jié)果顯示在大腸癌及癌旁組織中，XAF13個轉(zhuǎn)錄變異的陽性表達率的差異均無顯著性意義，大腸腺瘤及大腸癌組織中XAF1B、XAF1C的陽性率顯著低于正常人腸組織(P<0.05)； 3.免疫組織化學結(jié)果顯示，與正常黏膜和增

9、生性息肉組織相比，XAF1在腺瘤及癌組織的胞核表達強度降低(P<0.05)，胞漿表達強度強度增高(P<0.05)，總體表達強度降低(P<0.05)； 4.MTT結(jié)果顯示在不同的血清濃度下(4％、10％)XAF1A都有抑制細胞增殖的作用(P<0.05)；瞬時轉(zhuǎn)染時，XAF1對細胞增殖的抑制作用隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量的增加而增強，XAF1-AS對細胞增殖的促進作用隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量的增加而增強；在不同細胞株中(SW1116、SW480)有類

10、似反應(yīng)； 5.熒光素酶報告基因檢測技術(shù)顯示XAF1能明顯抑制survivin啟動子和TCF/catenin啟動子活性(P<0.10)； 6.上調(diào)XAF1A蛋白的表達對腸癌細胞分化指標E-cadherin、Villin、Pan-CEA蛋白表達無明顯的影響。 結(jié)論： 1.XAF1三種轉(zhuǎn)錄變異體在腫瘤細胞株及正常轉(zhuǎn)化細胞株中均低表達或不表達； 2.XAF1A在腫瘤中的表達與正常組織中表達無明顯差異，XA