脂蛋白脂酶基因突變(C310R-E396V)致家族性高乳糜微粒血癥的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　我們?cè)趪?guó)際上首次發(fā)現(xiàn)兩個(gè)全新的脂蛋白酯酶基因的突變C310R（c.T928C）和E396V（c.A1187T）。本課題擬在人體水平和細(xì)胞水平上對(duì)該突變基因進(jìn)行功能性和分子機(jī)制研究，有助于構(gòu)建我國(guó)家族性高乳糜微粒血癥患者的脂蛋白脂酶基因突變型與表型關(guān)系譜。
　　方法：
　　提取先證者全體家族成員的外周血DNA，利用全外顯子測(cè)序技術(shù)確定脂蛋白脂酶突變位點(diǎn)，然后通過(guò)一代測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)需分別在攜帶脂蛋白脂酶

2、基因突變的患者和正常人體內(nèi)注射肝素（60IU/kg），通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)肝素后血漿中脂蛋白脂酶濃度，酶熒光法檢測(cè)脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性，非變性膠western blot檢測(cè)突變對(duì)于LPL二聚體形成的影響。體外實(shí)驗(yàn)構(gòu)建攜帶該突變基因位點(diǎn)的慢病毒表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，分別檢測(cè)細(xì)胞上清和裂解液內(nèi)脂蛋白脂酶的活性和濃度。通過(guò)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)該突變對(duì)于基因轉(zhuǎn)錄水平影響。
　　結(jié)果：
　　全外顯子測(cè)序結(jié)果顯示

3、先證者馬建華（I-2）的脂蛋白脂酶基因6號(hào)外顯子有一個(gè)新的T>C的雜合子突變(c.T928C)，該突變導(dǎo)致編碼的半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?p.C310R)；而馬超（II-1）則攜帶兩個(gè)脂蛋白脂肪酶基因復(fù)合雜合子突變，其中一個(gè)突變位點(diǎn)與馬建華相同，另一個(gè)突變位點(diǎn)位于8號(hào)外顯子A>T的突變（c.A1187T），該突變使編碼的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(p.E396V)。人體水平的研究發(fā)現(xiàn)先證者和 I-1血漿中脂蛋白脂酶的濃度和活性與正常人相比均明顯下降